Paisaje mutacional de las células de las criptas intestinales después de mucho tiempo.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13964 (2023) Citar este artículo

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La obesidad es un factor de riesgo modificable en el desarrollo del cáncer, especialmente el cáncer gastrointestinal. Si bien la etiología del cáncer colorrectal está bien caracterizada por la secuencia adenoma-carcinoma, aún no está claro cómo la obesidad influye en el desarrollo del cáncer colorrectal. Se ha demostrado que los componentes dietéticos de una dieta rica en grasas junto con la obesidad modulan el riesgo de cáncer al alterar la homeostasis de las células madre intestinales; sin embargo, no se ha estudiado cómo la adiposidad afecta el desarrollo de la inestabilidad genómica. Las firmas mutacionales son una forma poderosa de comprender cómo una respuesta biológica compleja afecta la estabilidad genómica. Utilizamos un modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta para estudiar el panorama mutacional de las células de las criptas intestinales después de una exposición de 48 semanas a una dieta experimental rica en grasas in vivo. Al enriquecer clonalmente células derivadas de criptas individuales en cultivos organoides y obtener secuencias genómicas completas, analizamos y comparamos el panorama mutacional de las células epiteliales intestinales de ratones con dieta normal y con dieta alta en grasas. Las firmas de sustitución de un solo nucleótido y las firmas indel presentes en nuestra cohorte se encuentran igualmente activas en ambos grupos de dieta y reflejan procesos biológicos de envejecimiento normal, replicación celular y estrés oxidativo inducidos durante el cultivo de organoides. Por lo tanto, demostramos que, en ausencia de mutaciones activadoras o exposición química, una dieta rica en grasas por sí sola no es suficiente para aumentar la inestabilidad genómica.

Las tasas mundiales de obesidad han aumentado constantemente durante los últimos 40 años1. La obesidad se acompaña de muchas comorbilidades, como una mayor probabilidad de diabetes tipo II, hipertensión y enfermedad del hígado graso no alcohólico1, 2. Entre los mayores impactos en la salud se encuentra el aumento del riesgo de cáncer que acompaña a la acumulación de grasa corporal3,4,5,6. La Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC) ha reconocido la abrumadora evidencia epidemiológica que vincula la obesidad crónica con un mayor riesgo de cáncer, en particular para los órganos a lo largo del eje gastrointestinal7. Especialmente el riesgo de desarrollar cáncer colorrectal (CCR) está muy influenciado por los factores de riesgo dietéticos y el alto índice de masa corporal (IMC)8. Con la clara asociación entre un IMC alto y el riesgo de CCR, comprender la etiología subyacente de la enfermedad podría servir de base para los programas preventivos y terapéuticos.

El desarrollo del cáncer colorrectal se define por una progresión bien descrita de mutaciones, conocida como secuencia adenoma-carcinoma9. Las mutaciones desactivadoras en la poliposis coli adenomatosa (APC) son mutaciones iniciadoras que conducen a la señalización constitutiva de Wnt/β-catenina. El cáncer colorrectal se desarrolla a través de tres vías moleculares diferentes, la vía de inestabilidad cromosómica (CIN), la vía de inestabilidad de microsatélites (MSI) y la vía de metilación de islas CpG (CIMP)10. Aunque el desarrollo del CCR es heterogéneo y a veces implica vías superpuestas, las tres vías se definen por la inestabilidad genómica que permite la adquisición de mutaciones adicionales en un conjunto de oncogenes y supresores de tumores, incluidos KRAS y BRAF (a menudo mutuamente excluyentes), TP53, PIK3CA. y SMAD410, 11. Curiosamente, se demostró que la pérdida concomitante de APC y p53 es suficiente para inducir altos niveles de inestabilidad cromosómica, característica de la vía CIN12. A pesar de que la genética molecular está bien definida en el desarrollo del CCR, aún no está claro cómo una dieta alta en grasas (HFD, por sus siglas en inglés) afecta esta serie de eventos.

Con la llegada de técnicas avanzadas de cultivo de tejidos, ha sido posible estudiar in vitro las poblaciones celulares más relevantes13. En el caso del CCR, la población celular de origen son las células madre intestinales (ISC) positivas para LGR5 de ciclo rápido (repetición rica en leucina que contiene el receptor 5 acoplado a proteína G), que residen en el fondo de la cripta14. Se ha demostrado que estas células son sensibles a las perturbaciones dietéticas y metabólicas, modulando el riesgo de inicio del cáncer15,16,17,18. Se ha demostrado que una exposición prolongada a los componentes de HFD confiere características de potencia a las células progenitoras que no son células madre, aumentando así el conjunto de células que se replican activamente16, 19. Se descubrió que el ácido palmítico, componente de HFD, inicia este efecto mediante la activación de PPAR-∂ ( señalización del receptor delta activado por proliferador de peroxisomas, que induce la señalización Wnt canónica16, 19. Otro metabolito destacado comúnmente asociado con la obesidad inducida por la dieta es el colesterol. Se descubrió que la exposición prolongada a niveles altos de colesterol también impulsa la proliferación de ISC y aumenta la tasa de tumorigénesis en un entorno deficiente en APC17.

Aunque se ha demostrado que una HFD modula directamente la señalización en el nicho de las células madre, aún no se ha estudiado el efecto sobre la estabilidad genómica. Más allá de describir mutaciones en genes individuales, las firmas mutacionales ofrecen un marco para estudiar sistemáticamente cómo surge la inestabilidad genómica en el desarrollo del cáncer. Las firmas mutacionales son un marco matemático que permite definir patrones de mutaciones dentro de su contexto de secuencia. La huella mutacional específica de una firma en el genoma es el reflejo de la desregulación o disfunción de las vías de reparación y daño del ADN y otros procesos biológicos20. Desde la concepción de las firmas mutacionales en 201321, 22, ha sido posible investigar los genomas del cáncer a nivel global y capturar patrones que describen complejos mecanismos biológicos subyacentes. Los estudios in vitro ascendentes, que miden el efecto mutagénico de una exposición o de un gen knockout, han demostrado ser especialmente útiles para definir etiologías distintivas23,24,25,26.

Aquí, investigamos si la exposición prolongada a una dieta rica en grasas genera distintos procesos mutacionales en las células de las criptas intestinales. Debido a que las firmas mutacionales capturan eficazmente procesos biológicamente complejos, sirven como una buena lectura para estudiar los efectos sobre la estabilidad genómica. Secuenciamos y analizamos organoides intestinales clonales derivados de ratones que fueron alimentados con un HFD experimental durante 48 semanas. Después del procesamiento de datos y la llamada de variantes, obtuvimos un número suficiente de mutaciones de sustitución de base única (SBS) e indel (ID) para investigar las firmas de SBS e ID, así como las mutaciones de codificación. Para ambos grupos de dieta, recuperamos firmas esperadas relacionadas con el envejecimiento, el procesamiento de cultivos de tejidos y la replicación celular. Demostramos que la mutagénesis diferencial no se inicia solo con la HFD en ausencia de otros eventos perturbadores, como la exposición química o mutaciones en los genes impulsores del CCR.

Para estudiar el efecto a largo plazo de la obesidad sobre la estabilidad genómica en la cripta intestinal, creamos una cohorte de ratones C57/BL6J machos de la misma edad (Fig. 1A). Después de la asignación aleatoria a jaulas con comida estándar (SD) o HFD, los ratones comenzaron con el curso de dieta respectivo a la edad de 5 semanas durante 48 semanas continuas. En intervalos de tiempo establecidos de 6, 12, 28 y 48 semanas, se extrajo y sacrificó una submuestra aleatoria de ratones HFD y SD para recolectar ISC para cultivo. Los organoides se seleccionaron y cultivaron hasta clonalidad antes de obtener secuencias del genoma completo (30 ×) para 5 ratones obesos y 5 ratones delgados desde el último momento (48 semanas). Para cada ratón, se secuenciaron 4 clones organoides independientes y la cola correspondiente para distinguir las variantes adquiridas de las variantes de la línea germinal. Las líneas de organoides clonales adquieren una morfología quística característica de los organoides intestinales con alto contenido de células madre13 y son positivas para la expresión de Lgr5 (Figuras complementarias 1A, B).

(A) Visualización esquemática del flujo de trabajo experimental. (B) Macronutrientes de dietas experimentales mostrados por porcentaje de contribución al total de calorías. HFD se muestra en azul claro y SD en marrón claro. (C) Consumo de alimentos por grupo de dieta, medido por jaula y dividido por el número de ratones por jaula. El promedio del grupo y la significación estadística se indican arriba (prueba t no apareada, de dos colas) (D) Contenido de colesterol en plasma en mg/dl mostrado por grupo de dieta en cada punto del transcurso del tiempo. N = 3 para cada grupo en los puntos temporales semana 6, 12, 28 y N = 5 en la semana 48 (prueba t por pares, de dos colas). (E) Mediciones de peso semanales para grupos de dieta. Los puntos indican medidas para ratones individuales. Se observó un aumento de peso estadísticamente significativo después de 3 semanas en el HFD (indicado por la línea roja). La significación estadística se probó utilizando múltiples pruebas t no pareadas con alfa = 0,001 (método de corrección de Holm-Sidak para pruebas múltiples, sin asumir una desviación estándar consistente entre grupos). .

Nuestro modelo de obesidad inducida por la dieta se basa en la elección de la dieta suministrada. En la condición de dieta alta en grasas, los ratones obtienen el 60% de todas las calorías de la grasa, mientras que la mayoría de las calorías en la dieta normal (SD) derivan de los carbohidratos (55,5%) (Fig. 1B). La composición exacta de la dieta se describe en las Tablas complementarias 1 y 2. A pesar del menor consumo general de alimentos en el grupo HFD (Fig. 1C), la ingesta calórica semanal media fue mayor en el grupo HFD (92,7 kcal/semana) en comparación con el grupo SD ( 80,2 kcal/semana). Los ratones C57BL/6J han sido bien caracterizados como organismos modelo para la obesidad inducida por la dieta, capturando aspectos esenciales de la desregulación metabólica y el aumento de peso27, 28. Nuestra cohorte también exhibió un marcado aumento en el colesterol total tras la exposición a la HFD (Fig. 1D) y una significativa aumento del peso corporal después de 3 semanas con la DFH (Fig. 1E), recapitulando las desregulaciones metabólicas y el fenotipo resultante asociado con la obesidad.

Dado que el genoma registra procesos mutacionales pasados y en curso, razonamos que una exposición más prolongada a la HFD daría como resultado una señal más fuerte. Por lo tanto, centramos nuestros esfuerzos de secuenciación en el último momento (48 semanas). Las lecturas sin procesar obtenidas se procesaron de acuerdo con las mejores prácticas de GATK (The Genome Analysis Toolkit) (Fig. 2A). Para obtener un conjunto de mutaciones de alta confianza, utilizamos dos llamadores de mutaciones, Mutect229, 30 y Strelka231. Las mutaciones que fueron encontradas tanto por Mutect2 como por Strelka2 y que pasaron las respectivas configuraciones de filtro de calidad se incluyeron para un análisis adicional. Esto arrojó un total de 48.742 variantes de un solo nucleótido (SNV), 165 sustituciones de doble nucleótido (DSB) y 6.662 indeles (inserciones y eliminaciones). Debido al bajo número de mutaciones, los DSB se excluyeron de análisis adicionales. Como paso adicional de control de calidad, verificamos la distribución de frecuencia de alelos variantes (VAF) de todos los clones de organoides e incluimos solo muestras clonales, donde la distribución de VAF se centra alrededor de 0,5 (Figura complementaria 1C).

(A) Las lecturas sin procesar de la secuenciación de Illumina de 150 pb del extremo emparejado se procesaron de acuerdo con las mejores prácticas de GATK, incluido el marcado y la eliminación de duplicados y la recalibración de las puntuaciones de calidad base. Las lecturas listas para el análisis fueron procesadas por dos llamadores de mutaciones, Mutect2 y Strelka2. Se incluyeron en el análisis las variantes llamadas por ambas herramientas. En total, se pudieron detectar 48.742 variantes de un solo nucleótido, 165 variantes de sustitución de doble base y 6.662 inserciones y eliminaciones. (B) Contribución relativa de SNV en seis clases de mutación para muestras HFD (panel izquierdo) y muestras SD (panel derecho). Las mutaciones C > T dentro de los sitios CpG se muestran como una categoría separada. Los puntos individuales indican muestras de organoides, las barras de error muestran ± 1 sd de la media, los asteriscos indican resultados de la prueba t por pares (de dos caras) que compara los números de mutación para cada categoría de mutación, alfa = 0,05 (C) Perfil mutacional promedio de SNV en 96 canales mostrados para HFD (panel superior) y SD (panel inferior). Las barras de error indican ± 1 sd.

Primero exploramos el panorama mutacional general de los SNV por grupo de dieta. Sorprendentemente, encontramos un número ligeramente mayor de mutaciones totales en el grupo SD que en el grupo HFD. Observamos un número significativamente mayor de mutaciones en el grupo SD para C > G, C > T fuera de las regiones CpG, T > C y T > G (Fig. 2B). Sin embargo, el perfil de contribuciones relativas a través de los 7 canales de mutación es similar entre los dos grupos de dieta. A continuación, examinamos los perfiles mutacionales en 96 canales. El perfil mutacional medio por grupo de dieta muestra pocos picos característicos, con la excepción de los componentes C > A y C > T. El perfil agregado del grupo HFD tiene una similitud de coseno de 0,9929 con el grupo SD (Fig. 2C). Además, observamos perfiles muy similares entre ratones de cualquier grupo de dieta (Figuras complementarias 2A, B). Para cuantificar qué tan similares son los perfiles mutacionales de las muestras entre los grupos de dieta, calculamos la similitud del coseno por pares entre todas las muestras, que varía de 0,9020 a 0,9776 (media = 0,9558) (Figura complementaria 2C).

La alta similitud de coseno entre todas las muestras implica la ausencia de fuertes procesos mutacionales diferenciales. Para probar esto, utilizamos un método de remuestreo de arranque de la matriz de mutación de 96 canales, adaptado de Zou et al., para muestras SD y HFD24. Esto nos permite detectar posibles diferencias cualitativas en los perfiles mutacionales que permanecen descubiertas debido al bajo tamaño de la muestra y la alta relación señal-ruido. El perfil mutacional inicial global de los ratones SD tiene una similitud de coseno de 0,9933 en comparación con el perfil de los ratones HFD (Figura complementaria 2D).

En resumen, esto sugiere que no existen fuertes diferencias cualitativas para los procesos mutagénicos en ninguno de los grupos de dieta.

A pesar de la falta de diferencias cualitativas en los perfiles mutacionales de los dos grupos de dieta, a continuación buscamos explorar qué firmas mutacionales están activas en los grupos de dieta para determinar si existen diferencias cuantitativas. Primero empleamos la factorización matricial no negativa (NMF) con selección de rango automatizada basada en el método NMFk para determinar el número óptimo de firmas de novo para extraer32, 33. Clásicamente, los algoritmos NMF utilizan heurísticas para determinar el rango óptimo en función de cualquier estabilidad. de la solución, o en la determinación automática de relevancia (ARD), que es una medida de precisión del modelo elegido para explicar los datos33. Por el contrario, el método NMFk para la determinación automática de rangos busca optimizar el equilibrio entre la estabilidad de la solución y la precisión de los datos reconstruidos, medidos como la distancia entre los perfiles originales y reconstruidos (distancia media del coseno de la muestra). Este método permite extraer de forma sólida una cantidad significativa de firmas de datos ruidosos y al mismo tiempo minimizar la cantidad de firmas falsas positivas32.

Aplicado a nuestros datos, tanto la estabilidad como la distancia media del coseno de la muestra disminuyen a medida que se extraen más firmas. Por tanto, la solución más óptima consiste en extraer una firma única (Fig. 3A). La presencia de un perfil de consenso único en la cohorte indicaría que no existen firmas distintivas entre los grupos de dieta. Además, la firma extraída de novo se puede descomponer en firmas conocidas de la base de datos del catálogo de mutaciones somáticas en cáncer (COSMIC)34. Según esta descomposición, la firma de novo consta de 48,1% de SBS5, 42,56% de SBS18 y 9,34% de SBS1 (Fig. 3A). La comparación de la contribución por muestra de las firmas descompuestas revela una distribución igual de las actividades de las firmas entre las muestras, independientemente de la dieta utilizada (Fig. 3B).

(A) NMF para extracción de firmas que van de 1 a 4 firmas. La línea roja indica la distancia media del coseno de la muestra (MSCD), la línea azul indica la estabilidad promedio (AS), la barra gris indica la solución preferida, maximizando la compensación entre MSCD y AS. A la derecha se muestra la descomposición de la firma extraída en firmas COSMIC conocidas y su contribución porcentual calculada. (B) Los resultados de NMF de A se muestran según las contribuciones de firma absoluta de la muestra (número de mutaciones), el estado de la dieta de las muestras se indica en la parte inferior. (C) Mejor subconjunto de reacondicionamiento de firmas utilizando firmas comúnmente activas en el cáncer colorrectal. Las contribuciones de firma absoluta por muestra (número de mutaciones) se muestran para muestras HFD (panel superior) y muestras SD (panel inferior). (D) Prueba de presencia de firma para las 4 firmas más activas. El eje y indica la relación de probabilidad entre la firma que se ajusta con y sin la firma probada. La translucidez de las barras, que se muestra para clones de organoides individuales, es indicativa del nivel de significancia (-log p).

En cohortes con números de muestra más bajos como la nuestra, un enfoque alternativo a la extracción de novo es el reacondicionamiento de firmas, donde el catálogo mutacional de las muestras se ajusta al catálogo de firmas conocidas (COSMIC) para encontrar un subconjunto que explique mejor las mutaciones observadas. catalogar. Este enfoque toma un conjunto definido de firmas conocidas y realiza un reacondicionamiento de manera iterativa. Después de cada iteración, se comparan el perfil reconstruido y el original y se elimina del conjunto la firma con menor contribución. Las firmas dejarán de eliminarse cuando la similitud del coseno entre el perfil reconstruido y original entre dos iteraciones haya cambiado más que un umbral determinado. Por lo tanto, sólo se conservan en el conjunto las firmas que son necesarias para modelar los datos observados. Al repetir este proceso n − 1 veces para todos los conjuntos de n − 1, n − 2, n − 3, etc., donde n es el número total de firmas conocidas, encontramos que SBS1, SBS5, SBS18 y SBS40 explican el 99,6%. de mutaciones observadas en ambos grupos de dieta (Fig. 3C). Sólo cuatro muestras mostraron una actividad mínima de SBS15 (reparación de errores de coincidencia defectuosa), una firma directamente atribuible a un aumento de la inestabilidad genómica. Sin embargo, el número igualmente mínimo de mutaciones atribuidas a SBS15 en ambos grupos de dieta no sugiere un potencial diferencial en la reparación de desajustes entre SD y HFD. En resumen, la distribución de las firmas ajustadas es muy similar entre las muestras y no es específica de la dieta.

Para cuantificar la actividad de las firmas más activas aplicamos la prueba de presencia de firmas del paquete mSigAct35, 36 a SBS1, SBS5, SBS18 y SBS40. Esta prueba estadística construye dos modelos de reacondicionamiento, uno que incluye y otro que excluye la firma de interés, minimizando al mismo tiempo el error de reconstrucción. A continuación, se calcula la prueba de razón de verosimilitud entre los dos modelos. Para proporciones mayores que 1, la probabilidad de que la firma esté activa es significativamente mayor que la hipótesis alternativa. La prueba de presencia de firma confirmó los resultados obtenidos al reajustar la firma. De las 4 firmas probadas, SBS5 es la menos activa, como ya se observó antes (Fig. 3D). Aunque se puede observar cierta variación en la actividad de las firmas entre muestras individuales, ninguna firma muestra una diferencia sistemática entre las dietas.

Todas las firmas que encontramos son igualmente activas en ambos grupos de dieta y probablemente sean atribuibles a procesos normales de envejecimiento y al proceso de cultivo antes de la secuenciación. SBS1 es una firma similar a un reloj que se atribuye al envejecimiento debido a la desaminación espontánea de 5-metilcitosinas, lo que conduce a una transición C > T21. Por lo tanto, la actividad de SBS1 observada en ambos grupos probablemente refleje el proceso de envejecimiento normal. Además, ambos grupos mostraron un gran número de mutaciones C > A, que se atribuyeron en gran medida a SBS18. Se ha propuesto que esta firma es causada por daños debidos a especies reactivas de oxígeno22, 25 y, por lo tanto, podría haber surgido durante el manejo experimental de rutina de las muestras o debido a la exposición a subproductos metabólicos en el intestino. Las firmas restantes SBS5 y SBS40 comparten perfiles planos similares. Aunque sólo SBS5 ha sido claramente identificado como una firma similar a un reloj, también se encontró que SBS40 se correlaciona con la edad22, 37. Por lo tanto, la actividad de ambas firmas puede explicarse por procesos normales de envejecimiento. En conjunto, los resultados de la extracción de novo y el reacondicionamiento de la firma confirman que la HFD experimental no indujo ni afectó diferentes procesos mutacionales para las sustituciones de un solo nucleótido en comparación con la dieta estándar.

Además de los SNV, numerosos procesos mutacionales también generan inserciones y eliminaciones. Esta clase de mutaciones genera firmas diferentes a las firmas SNV. Por lo tanto, analizamos las 6662 mutaciones de indel en nuestra cohorte para comparar si existen diferencias en los procesos mutacionales que generan indel entre los grupos de dieta. Solo consideramos muestras clonales con una distribución de VAF centrada en alrededor de 0,5 (Figura complementaria 3). Las mutaciones Indel se pueden analizar en 16 o en 83 canales seleccionados, que representan el contexto de secuencia principal y extendido respectivamente38. Los tipos de indel seleccionados van desde la eliminación o inserción de un solo par de bases hasta indeles de más de 5 pb. Además, se consideran deleciones de 1 a 5 pb flanqueadas por microhomologías, ya que tales mutaciones son indicativas de procesos defectuosos de reparación de roturas de doble cadena39. Los perfiles de Indel en ambos contextos de secuencia fueron muy similares entre los grupos de dieta, con una similitud de coseno de 0,9925 para los contextos de indel principales (Fig. 4A) y de 0,9941 para los contextos de indel extendidos (Fig. 4B). Solo las eliminaciones de más de 5 pb flanqueadas por microhomologías aumentaron significativamente en la SD en comparación con la cohorte HFD (Fig. 4A). Sin embargo, dado que el número total de mutaciones en esa categoría es inferior a 10, es probable que esto represente una variación aleatoria y no tenga ningún significado biológico específico. De hecho, todos los ratones, independientemente del grupo de dieta, exhibieron perfiles indel muy similares, tanto para el contexto de secuencia principal como para el extendido (Figuras complementarias 4A a D). Además, todas las muestras mostraron una similitud de coseno por pares mayor que 0,84 (Figura complementaria 4E). En conclusión, la alta similitud de coseno entre los perfiles indel de los grupos de dieta, así como entre las muestras individuales, sugiere que ningún proceso generador de indel es exclusivo de ninguna de las dietas.

(A) Perfiles del contexto indel principal (16 canales) agregados por grupo de dieta (media), las barras de error indican ± 1 sd. La significación estadística se evaluó mediante pruebas t de pares múltiples, sin asumir una desviación estándar consistente (método de corrección de Holm-Sidak para pruebas múltiples, alfa = 0,01) (B) Perfil indel de contexto extendido medio por grupo de dieta (83 canales), las barras de error indican ± 1 sd de la media. (C) Gráfico de diagnóstico NMF para la extracción de firmas que van de 1 a 4 firmas. La línea roja indica la distancia media del coseno de la muestra (MSCD), la línea azul indica la estabilidad promedio (AS), la barra gris indica la solución preferida, maximizando la compensación entre MSCD y AS. A la derecha se muestra la descomposición de la firma extraída en firmas indel COSMIC conocidas y su contribución porcentual calculada. (D) Los resultados de NMF de A se muestran según las contribuciones de firma absoluta de la muestra (número de mutaciones), el estado de la dieta de las muestras se indica en el eje x. (E) Mejor reacondicionamiento de firmas de subconjunto utilizando las 18 firmas indel conocidas. Se muestran las contribuciones de firma absoluta por muestra (número de mutaciones). El estado de la dieta se indica en el eje x. (F) Reacondicionamiento iniciado de firmas indel (el mejor enfoque de subconjunto que utiliza todas las firmas indel conocidas, 100 iteraciones). El tamaño de los puntos indica la contribución media de la firma para todas las iteraciones de arranque en las que se encontró esta firma. La escala de colores representa el porcentaje de iteraciones de arranque en las que la firma se encontró activa. (G) Prueba de presencia de firmas para las 4 firmas más activas encontradas en reacondicionamiento y reacondicionamiento inicial. El eje x indica la muestra, el eje y indica la relación de probabilidad entre la firma que se ajusta con y sin la firma probada. La translucidez de las barras, que se muestra para clones de organoides individuales, es indicativa del nivel de significancia (- log p).

Luego aplicamos el mismo flujo de trabajo de análisis que establecimos para las firmas SNV a todas las inserciones y eliminaciones. NMF con selección de rango automatizada encontró una firma indel como la solución óptima porque la extracción de más de una firma condujo a una fuerte disminución en la estabilidad promedio (Fig. 4C, panel izquierdo). La descomposición de la firma única de novo estimó que tres firmas COSMIC conocidas estaban activas, ID1 (22,46%), ID2 (40,88%) e ID12 (36,66%) (Fig. 4C, panel derecho). La distribución de la contribución de la firma a las muestras individuales no difiere entre los grupos de dieta (Fig. 4D).

Explorar más a fondo las firmas indel con análisis de reacondicionamiento nos permitió confirmar los resultados obtenidos de la extracción de novo. Utilizando el mejor reajuste de subconjunto con las 18 firmas indel conocidas, encontramos que ID1, ID2 e ID12 son los más activos y distribuidos de manera similar en las muestras (Fig. 4E). La actividad menor observada para ID7 (deficiencia de MMR37) e ID9 (etiología desconocida37) puede deberse a una atribución errónea de firmas para las deleciones comunes de C y T encontradas en nuestra cohorte. Dado que el bajo número de mutaciones puede ser limitante en este análisis, también agrupamos la matriz mutacional de cada grupo de dieta y realizamos un mejor ajuste del subconjunto para todas las firmas de indel COSMIC. Los resultados muestran una distribución igual de la actividad ID1, ID2 e ID12 entre los grupos de dieta (Figura complementaria 4F). Para confirmar la estabilidad del reacondicionamiento, realizamos un reacondicionamiento inicial. La matriz mutacional se vuelve a muestrear 1000 veces con reemplazo, utilizando el perfil mutacional original como peso. Para cada iteración de arranque se calcula un reajuste, registrando la actividad de firma estimada. Cuanto mayor sea el consenso de reajustes entre las iteraciones de arranque, más estable será el reajuste. Los resultados confirman que ID1, ID2 e ID12 son las firmas más activas en nuestra cohorte, independientemente de la dieta consumida. ID7 se encontró activo solo en el grupo SD y se le atribuyó menos del 10% de todas las mutaciones en ese grupo (Fig. 4F). Finalmente, cuantificamos la actividad de firma de ID1, ID2, ID7 e ID12 para todas las muestras, utilizando la prueba de presencia de firma (Fig. 4G). Los resultados confirman que ID2 e ID12 (de etiología desconocida37) son las firmas más activas en ambos grupos de dieta, ya que la mayoría de las mutaciones se atribuyen a estas firmas en todas las muestras. ID1 es la tercera firma indel más activa, seguida de ID7, que está activa solo en algunas muestras y completamente ausente en el 23% de todas las muestras.

Ninguna de las firmas indel identificadas es diferencialmente activa entre las dietas probadas. Se propone que las firmas ID1 e ID2 surjan debido al deslizamiento de la cadena replicada (ID1) y de la plantilla (ID2) durante la replicación, produciendo las inserciones T características de 5 + pb y las eliminaciones T de 6 + pb. Se ha observado que estas firmas están activas en todas las muestras y solo aumentan en fondos con deficiencia de reparación de errores de coincidencia (MMR)37. En nuestra cohorte, no hemos observado una fuerte actividad de las firmas SNV o indel asociadas con la reparación defectuosa de desajustes. La baja actividad de la firma ID7 de deficiencia de MMR en algunas muestras puede explicar parcialmente la alta actividad observada para ID1 e ID2. Sin embargo, este proceso es igualmente activo en ambos grupos de dieta (Fig. 4E,G). En particular, se encontró que la actividad de ID1 e ID2 aumentaba en condiciones de inflamación crónica del tracto intestinal en pacientes40. Aunque la obesidad se asocia con cambios en la señalización metabólica y hormonal asociados con la formación de un ambiente inflamatorio6, no observamos un aumento en la actividad ID1 e ID2 que indicaría fuertes cambios en la señalización inflamatoria. Por lo tanto, la actividad de ID1 e ID2 que encontramos en ambos grupos de dieta sugiere procesos mutacionales en curso durante la replicación celular normal. En resumen, los resultados indican que el HFD experimental no invocó ni influyó en los procesos mutacionales de generación de indel.

Finalmente, nos preguntamos si la ausencia de procesos mutacionales específicos también impedía la acumulación de mutaciones perjudiciales específicas que podrían iniciar la secuencia adenoma-carcinoma y, por lo tanto, predisponer al desarrollo de tumores. Para probar esto, exploramos las mutaciones codificantes que se acumularon en cada grupo de dieta. Debido al bajo número de mutaciones codificantes en nuestra cohorte, incluimos todas las mutaciones que pasaron los criterios de filtrado de la variante Mutect2. El filtrado de los genes más mutados reveló una superposición notable: 9 de los 10 genes más mutados se comparten entre el grupo SD y HFD (Fig. 5A, B). La mayor fracción de alteraciones son mutaciones sin sentido. Ninguno de los genes mutados tiene un papel conocido en el desarrollo del cáncer intestinal. En conjunto, no encontramos mutaciones específicas que puedan explicar cómo la obesidad aumenta el riesgo de desarrollar cáncer en el tracto intestinal.

(A) Las 10 mutaciones codificantes principales en ratones HFD (B) y SD. El tipo de sustitución se indica por color. A la derecha se indica el porcentaje de muestras con una mutación en el gen.

La obesidad es una enfermedad crónica que epidemiológicamente ha demostrado aumentar el riesgo de desarrollar cáncer en el tracto intestinal3,4,5,6,7. Se ha demostrado que un IMC alto y factores dietéticos como el consumo de una dieta de estilo occidental rica en grasas tienen una asociación positiva con el riesgo de CCR a través de la modulación de la señalización en el nicho de las células madre intestinales15,16,17,18,19. Sin embargo, aún no se ha investigado el efecto de la obesidad sobre la estabilidad genómica de las células madre intestinales. Nuestra hipótesis es que la exposición crónica a un DFH afecta el daño del ADN y la señalización de reparación o los procesos asociados y, por lo tanto, da forma al panorama de la estabilidad genómica en las células madre intestinales. Para investigar el panorama mutacional en respuesta a la obesidad inducida por la dieta, utilizamos la secuenciación del genoma completo en poblaciones clonales de organoides derivadas de células de criptas intestinales de ratones expuestos a dietas experimentales ricas en grasas o de control, respectivamente.

Nuestros resultados muestran que la HFD sola, sobre un fondo isogénico y en ausencia de otras mutaciones predisponentes, no induce firmas mutacionales diferenciales en comparación con una dieta de control estándar. Todas las firmas mutacionales que recuperamos son igualmente activas en ambos grupos de dieta y representan procesos mutacionales normales en curso asociados con el envejecimiento (SBS1, SBS5), la replicación celular (ID1, ID2) o el estrés oxidativo experimentado in vivo o durante el proceso de cultivo durante la muestra. preparación (SBS18). En general, las firmas que recuperamos concuerdan con hallazgos anteriores, que informan la actividad de SBS1, 5 y 18, así como de ID1 e ID2 como procesos normales asociados al envejecimiento y al metabolismo en las criptas del colon40. Otras firmas recuperadas fueron SBS40 e ID12, ambas firmas con etiología desconocida y estaban activas en ambos grupos de dieta. Además, no encontramos mutaciones codificantes en genes impulsores de CCR comunes u otros genes asociados con el desarrollo de inestabilidad genómica. Por lo tanto, en ausencia de otras mutaciones predisponentes, las alteraciones asociadas a la obesidad inducida por la dieta en cualquier vía molecular en el nicho de las células madre no son suficientes para generar un exceso de mutaciones, patrones mutacionales específicos o mutaciones codificantes que predispondrían al cáncer. La falta de mutagénesis en la condición de DFH, tanto en términos de número de mutaciones como de firmas mutacionales, sugeriría que la maquinaria de reparación del ADN está funcionando eficientemente en la condición de obesidad inducida por la dieta, asegurando la estabilidad genómica. Si bien no perfilamos los cambios epigenéticos en este estudio, se sabe que la HFD induce la remodelación epigenética del paisaje potenciador en células epiteliales del colon murino, activando potenciadores de genes asociados al CCR41, 42. La exposición prolongada a la HFD eventualmente conduce a la reprogramación transcripcional, la regulación negativa supresores de tumores, al mismo tiempo que regulan positivamente los genes asociados con una mayor proliferación, sin iniciar tumores en ausencia de factores estresantes adicionales43. Considerando nuestros resultados en el contexto de estudios previos, esto indicaría que tanto los cambios epigenéticos como la regulación del daño del ADN y la maquinaria de reparación cambian en conjunto en respuesta a la HFD y preparan el epitelio intestinal hacia el inicio del cáncer. Queda por investigar cómo impacta una HFD en la mutagénesis en un entorno con predisposición al cáncer (por ejemplo, ApcMin) o en presencia de agentes que dañan el ADN.

Ante la evidencia epidemiológica convincente, sigue siendo importante comprender cómo una dieta de estilo occidental modula el riesgo de cáncer en el tracto gastrointestinal. Al investigar la mutagénesis en las células de las criptas intestinales tras una exposición prolongada a una dieta rica en grasas in vivo, demostramos que la HFD por sí sola, en ausencia de otros eventos de perturbación, como mutaciones o exposición química, no es suficiente para iniciar patrones mutacionales específicos. Nuestros resultados podrían conducir a futuros estudios para investigar los efectos combinatorios de la HFD con otras perturbaciones, para continuar dilucidando la etiología de los cánceres inducidos por la obesidad.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de experimentación con animales de la Universidad Médica de Viena y el Ministerio de Ciencia de Austria bajo el permiso ético número 66.009/0179-V/3b/2019. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. El estudio se informó de acuerdo con las directrices ARRIVE. Los ratones experimentales eran machos de la misma edad en un entorno C57BL/6J. El número total de ratones incluidos en el estudio fue 28. A los grupos de control y de tratamiento (grupos de dieta) se les asignó aleatoriamente un número de jaulas antes de agregar las dietas de investigación experimental. Los investigadores no estaban cegados al tratamiento asignado.

Poco después, a partir de las 5 semanas de edad, después de un período de aclimatación de 1 semana con SD, los ratones fueron alimentados con SD o HFD durante 6, 12, 28 y 48 semanas (dietas de investigación, D12492i, dieta para roedores con 60 kcal% de grasa, para dieta composición, ver tablas complementarias 1, 2). Los ratones se alojaron en el Departamento de Genética y Ciencia de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Viena, Austria, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a agua y alimentos. Se controló semanalmente el aumento de peso y el consumo de alimento de los animales de experimentación. En el momento del exitus experimental, los ratones se sacrificaron después de 3 h de ayuno. Se aislaron sangre, plasma, tejidos intestinales y criptas intestinales del yeyuno para cultivo de organoides. Se recogió sangre de la vena cava con una jeringa, se almacenó en tubos de recogida que contenían EDTA y se centrifugó durante 15 minutos a 2000 g. El plasma sobrenadante se recuperó y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido.

El tejido aislado del yeyuno se enjuagó suavemente con PBS helado (20 ml, sin Mg++ ni Ca++) usando una jeringa. El tubo intestinal se cortó longitudinalmente y se cubrió con PBS fresco (1-2 ml, sin Mg++ ni Ca++)). Las vellosidades se rasparon suavemente utilizando un cubreobjetos para microscopio. Después de esto, el tejido se cortó en ca. Trozos de 0,5 cm de largo y se agregaron a un tubo que contenía PBS helado (50 ml, sin Mg++ ni Ca++). Los trozos de tejido se lavaron invirtiendo suavemente el tubo antes de recoger los trozos de tejido y repitiendo este proceso de lavado 2 veces más con PBS fresco. Después del lavado, se recogieron trozos de tejido y se incubaron en tampón de disociación libre de enzimas (StemCell Catálogo #100-0485) durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rodillo de tubo. Después de la incubación, el tubo se agitó vigorosamente para soltar las criptas del tejido restante. La solución resultante se filtró a través de un filtro celular de 70 µm y se centrifugó durante 3 minutos a 1200 rpm. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en PBS nuevo (1 ml). Se transfirieron múltiples alícuotas de 50 µl, 100 µl y 200 µl a tubos de 1,5 ml y se centrifugaron durante 5 minutos a 500 rcf. El sobrenadante se eliminó con cuidado y se añadió Matrigel (20 µl) y se mezcló con el sedimento. La mezcla se sembró en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos (20 µl por pocillo), se invirtió la placa y se incubó durante 5 minutos a 37 °C para permitir que Matrigel se polimerizara. Finalmente, las gotas se cubrieron con 250–300 µL de medio de cultivo WENR (DMEM/F12 avanzado, 1% Glutamax (200 mM), 1% HEPES (1 M), 1% penicilina/estreptomicina, 2% B27 (50x, Thermo). Fischer Catálogo #17504044), 0,25% n-acetil-l-cisteína (500 mM), 0,05% EGF murino recombinante (500 µg/mL), 0,1% Noggin murino recombinante (100 µg/mL, Catálogo Peprotech #250-38) , Primocina al 0,2 % (50 mg/mL, catálogo InVivoGen n.º ant-pm-05), Y-27632 al 0,01 % (100 mM, catálogo Adooq Bioscience n.º A11001-50), nicotinamida al 1 % (1 M), Wnt3A acondicionado al 50 % medio como se describió anteriormente, medio acondicionado con 10% de R-espondina preparado como se describió anteriormente).

Después de 5 a 7 días en cultivo, los organoides se recuperaron de Matrigel y se disociaron en células individuales usando tripsina-EDTA al 0,05% (incubación a 37 ° C durante 5 a 12 minutos) y disrupción mecánica mediante pipeteo vigoroso. Se sembraron células individuales en alícuotas cada vez más diluidas y se comprobaron bajo el microscopio para comprobar su dispersión completa. Los organoides clonales resultantes se recogieron con una pipeta después de 7 a 10 días de cultivo (cambio de medio cada 2 a 3 días), se rompieron con tripsina-EDTA al 0,05 % y se cultivaron hasta que hubo suficiente material disponible para la extracción de ADN.

Los organoides se recogieron en DMEM/F12 frío, se sedimentaron mediante centrifugación a 500 rcf durante 5 min y se digirieron con TrypLE 1x durante 5 min a 37 °C. Después de la digestión, los organoides se lavaron con PBS frío y se sedimentaron mediante centrifugación a 500 rcf durante 5 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 µl de tampón RIPA (NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, 50 ml de TRIS pH 8,0), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20 °C. hasta mayor análisis. La concentración de proteína de diluciones 1:3 y 1:10 se determinó mediante el ensayo BCA (#23227, Thermo Scientific) por duplicado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se diluyeron 10 µg de proteína en tampón RIPA hasta un volumen total de 15 µl (12 µl + 3 µl de tampón de muestra reductor de marcador 5xLane (#39000, Thermo Scientific)). Las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida prefabricado al 4-15 % (n.° 4568086, BioRad) junto con la escalera de proteínas preteñida (PageRuler™ de 10 a 180 kDa, n.° 26616, Thermo Scientific). La página SDS se ejecutó en tampón de ejecución 1x a 100 V durante 5 min y posteriormente a 85 V durante 1,5 h (tampón de ejecución 10x: TRIS 0,25 M, glicina 1,924 M, SDS 0,03467 M). La membrana de nitrocelulosa se activó en metanol durante 5 minutos, se lavó en 1 x tampón de transferencia y la transferencia semiseca se realizó a 22 V durante 22 min (10 x tampón de transferencia: glicina 1,924 M, TRIS 0,25 M, MeOH al 10%). La transferencia se lavó brevemente en PBS-T, se bloqueó durante 1 h en PBS-T con leche al 5 % a temperatura ambiente y se incubó con anticuerpo primario en 10 ml de leche al 5 % en PBS-T durante la noche a 4 °C (Lgr5: ab75850, abcam 1:1000). Al día siguiente, la transferencia se lavó 3 x 5 min en PBS-T, se incubó con anticuerpo secundario (n.º 7074S, señalización celular 1:10 000) en 10 ml de leche al 5 % en PBS-T durante 1 h a temperatura ambiente y se lavó 3 x 5 min en PBS-T. La detección se realizó utilizando el sustrato de máxima sensibilidad Femto SuperSignal West (n.º 34095, Thermo Scientific). La quimioluminiscencia se registró utilizando un sistema Chemidoc XRS+ (BioRad). Después de la detección, la transferencia se lavó brevemente en PBS-T, se eliminó en 50 ml de tampón de extracción (n.º 21059, Thermo Scientific) a 37 °C, se lavó en PBS-T y se volvió a bloquear durante 1 h en PBS-T de leche al 5 %. a temperatura ambiente y se volvió a sondear como se describe anteriormente (Gapdh: sc-32233, SantaCruz 1:8000, secundario: #7076S, Cell Signaling 1:10,000).

Los organoides se extrajeron del Matrigel agregando proteasa K (800 U, ~ 20 µg), centrifugando la solución a 500 rcf durante 5 minutos y desechando el sobrenadante. El ADN total (~ 1 µg/muestra) se extrajo utilizando un microkit QIAamp DNA (Catálogo Qiagen n.º 56304). La preparación de la biblioteca (insertos de 350 pb) y la secuenciación (PE de 150 pb) en una plataforma NovaSeq6000 (Illumina) se llevaron a cabo con Novogene, Cambridge, Reino Unido. Las lecturas sin procesar se procesaron de acuerdo con la recomendación de mejores prácticas de GATK4 para el preprocesamiento de datos para el descubrimiento de variantes. Las lecturas se asignaron al genoma de referencia del ratón mm10/GRCm38. Se redujo la resolución de todos los archivos bam para que coincidan con el archivo con la cobertura más baja utilizando el comando DownsampleSam de las herramientas Picard con una precisión de = 0,001. Las variantes de los clones organoides se denominaron Mutect2 y Strelka2, utilizando el ADN de la cola como referencia. Se incluyeron en el análisis las variantes con estado de filtro PASS que fueron llamadas por ambas herramientas. Para cada muestra, se trazó la distribución de frecuencia de alelos variantes (VAF). Todas las muestras que no tenían una distribución centrada en alrededor de 0,5 fueron excluidas de análisis posteriores.

La extracción de firmas mutacionales de novo utilizando NMF se realizó utilizando SigprofilerExtractor32. El reacondicionamiento y el trazado de la firma se realizaron utilizando el paquete MutationalPatterns en R44. El análisis de arranque de las firmas SNV se realizó como se describió anteriormente24. Brevemente, se aplicó un remuestreo de arranque para generar 10.000 réplicas de la matriz mutacional para muestras SD y muestras HFD respectivamente, utilizando la distribución subyacente de firmas en los 96 canales como peso. Los resultados se agregaron por grupo de dieta para generar un perfil mutacional de arranque promedio, que luego se comparó entre grupos utilizando similitud de coseno.

Todo el código utilizado para analizar los datos y producir las cifras está disponible en https://github.com/menchelab/hfd-mutagenesis.

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Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Koo por compartir sus conocimientos sobre tecnología de organoides y a los miembros del laboratorio Menche y del laboratorio Loizou por su revisión crítica del manuscrito. Nos gustaría agradecer a la Dra. Núria López-Bigas y al Dr. Abel González-Pérez (Instituto de Investigación Biomédica, Barcelona, España) por sus útiles debates y comentarios.

MM recibió el apoyo de una beca DOC de la Academia de Ciencias de Austria (25757, otorgada a MM). El laboratorio de Loizou fue financiado por una subvención ERC Synergy Grant (identificación del acuerdo de subvención DDREAMM: 855741, otorgada a JIL) y el Fondo Austriaco para la Ciencia (F79 Spezialforschungsbereiche, otorgada a JIL). CeMM está financiado por la Academia de Ciencias de Austria.

Estos autores contribuyeron igualmente: Mathilde Meyenberg y Anna Akobyan.

Centro de Investigación CeMM de Medicina Molecular de la Academia de Ciencias de Austria, 1090, Viena, Austria

Mathilde Meyenberg, Anna Hakobyan, Franziska L. Langner, Georg A. Busslinger, Jörg Menche y Joanna I. Loizou

Centro de Investigación del Cáncer, Centro Integral del Cáncer, Universidad Médica de Viena, 1090, Viena, Austria

Mathilde Meyenberg y Joanna I. Loizou

Departamento de Biología Estructural y Computacional, Laboratorios Max Perutz, Universidad de Viena, 1030, Viena, Austria

Mathilde Meyenberg, Anna Akobyan y Jörg Menche

Departamento de Medicina de Laboratorio, Universidad Médica de Viena, 1090, Viena, Austria

Nikolina Papac-Milicevic, Laura Göderle, Mateo Markovic y Christoph J. Binder

División de Gastroenterología y Hepatología, Departamento de Medicina Interna III, Universidad Médica de Viena, 1090, Viena, Austria

Franziska L. Langner y Georg A. Busslinger

Instituto de Biotecnología Molecular de la Academia Austriaca de Ciencias (IMBA), Viena BioCenter (VBC), Dr. Bohr-Gas 3, 1030, Viena, Austria

Ji Hyun Lee y Bon Kyoung Koo

Centro de Ingeniería del Genoma, Instituto de Ciencias Básicas, 55, Expo-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34126, República de Corea

Ji Hyun Lee y Bon Kyoung Koo

Laboratorio de Biología Computacional y Bioinformática, Centro Oncológico AC Camargo, São Paulo, 01508-010, Brasil

Israel Tojal da Silva

Facultad de Matemáticas, Universidad de Viena, 1090, Viena, Austria

Jörg Menche

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MM, AH, JM, BKK, CB y JIL concibieron los experimentos, MM, NPM, LG y Mateo M. realizaron los experimentos, MM, AH, ITS y JM analizaron los resultados. MM, FLL y GAB conceptualizaron, realizaron y analizaron experimentos de revisión. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jörg Menche o Joanna I. Loizou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. JIL es actualmente empleado de AstraZeneca.

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Meyenberg, M., Hakobyan, A., Papac-Milicevic, N. et al. Paisaje mutacional de las células de las criptas intestinales después de una exposición in vivo prolongada a una dieta rica en grasas. Informe científico 13, 13964 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41123-3

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Recibido: 15 de enero de 2023

Aceptado: 22 de agosto de 2023

Publicado: 26 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41123-3

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