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Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5021 (2023) Citar este artículo

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La traducción de proteínas (PT) disminuye con la edad en invertebrados, roedores y humanos. Se ha asumido que un PT elevado a edades tempranas es beneficioso para la salud y el PT termina disminuyendo como un subproducto pasivo del envejecimiento. En Drosophila, mostramos que una elevación transitoria del PT durante la edad adulta temprana ejerce impactos negativos duraderos en las trayectorias de envejecimiento y la proteostasis en la vejez. El bloqueo de la elevación de PT en las primeras etapas de la vida mejora considerablemente la esperanza de vida y la salud y previene la agregación de proteínas relacionada con la edad, mientras que la inducción transitoria de un aumento repentino de PT en las primeras etapas de la vida en cepas de moscas de larga vida anula sus beneficios de longevidad/proteostasis. La elevación del PT en las primeras etapas de la vida desencadena una disfunción proteostática, silencia las respuestas al estrés e impulsa el deterioro funcional relacionado con la edad a través del eje de la proteína de transferencia de lípidos y hormonas juveniles y la señalización de la línea germinal. Nuestros hallazgos sugieren que el PT se suprime de forma adaptativa después de la edad adulta temprana, lo que alivia la carga proteostática en la vejez, ralentiza el deterioro funcional relacionado con la edad y mejora la esperanza de vida. Nuestro trabajo proporciona un marco teórico para comprender cómo la dinámica del PT a lo largo de la vida da forma a las trayectorias futuras de envejecimiento.

La traducción de proteínas (PT) es un proceso celular esencial que desempeña un papel clave en el crecimiento y el desarrollo. El PT se produce en un nivel alto en edades tempranas, pero luego disminuye precipitadamente y permanece bajo durante la mediana edad en múltiples especies animales, incluidos los humanos1,2,3,4,5,6. Se podría esperar que reducir el PT fuera perjudicial para la salud porque podría provocar una escasez de proteínas celulares críticas y una renovación de proteínas más lenta, lo que permitiría que se acumulara más daño proteico. Sin embargo, se ha informado que la reducción del PT a lo largo de la vida ralentiza el deterioro funcional relacionado con el envejecimiento, prolonga la esperanza de vida7,8,9,10 y mejora la senescencia celular y las enfermedades relacionadas con la edad11,12,13,14,15,16. Observamos que, en todas las especies animales, el PT se eleva en la edad adulta temprana1,2,3,4,5,6, lo que implica que la supresión del PT durante toda la vida tendría el mayor impacto en esta ventana de tiempo crítica para promover la longevidad. Sin embargo, en general se ha pensado que un PT elevado a edades tempranas es beneficioso para la salud, mientras que el PT termina disminuyendo con el tiempo como un subproducto pasivo del envejecimiento. Aún se desconoce si esto es cierto y cómo las fluctuaciones dinámicas en el PT a lo largo del tiempo impactan el envejecimiento. Por lo tanto, modificamos transitoriamente el PT en diferentes etapas de la vida en Drosophila e investigamos cómo estas modificaciones afectaban los fenotipos del envejecimiento.

Descubrimos que la elevación transitoria del PT en la edad adulta temprana altera la homeostasis de las proteínas (proteostasis) en una etapa avanzada de la vida, desencadena la agregación de proteínas relacionada con la edad e impulsa las disminuciones relacionadas con la edad. Nuestros hallazgos también indican que la rápida caída del PT después de la edad adulta temprana es fundamental para reducir la carga proteostática, frenar el deterioro relacionado con la edad y mejorar la esperanza de vida y la salud. Esto sugiere que la disminución del PT relacionada con la edad, en lugar de ser simplemente un subproducto pasivo del envejecimiento, puede ayudar a promover un envejecimiento saludable. Nuestro trabajo proporciona un marco teórico para comprender cómo la dinámica del PT a lo largo de la vida da forma a las trayectorias de envejecimiento futuras y a la red de proteostasis.

En ambos sexos de Drosophila melanogaster, observamos una elevación del PT durante la edad adulta temprana (Fig. 1a femenina, Fig. 1a complementaria masculina). El PT aumentó ~5 veces desde el día 0 al día 2, y luego disminuyó notablemente. Esta observación fue consistente utilizando tres métodos independientes: incorporación de 35S-metiona (Fig. 1a, izquierda), incorporación de puromicina (Fig. 1a, centro) y ensayo indicador de ARNm de luciferasa in vitro (Fig. 1a, derecha). El último ensayo mide la capacidad de los lisados ​​para traducir el ARNm17 de luciferasa introducido. Por lo tanto, el ensayo de luciferasa se usó para verificar que el PT bajo en el día 0 no era un artefacto de la alimentación de sustratos marcados a moscas recién encerradas que pueden usar aminoácidos adquiridos por las larvas para el PT. Para investigar el impacto del aumento de PT en las primeras etapas de la vida en los fenotipos de envejecimiento, reprimimos transitoriamente el PT en la edad adulta temprana (días 0 a 10) con un inhibidor de PT ampliamente utilizado (cicloheximida, CHX) (Fig. 1b). También alimentamos a las moscas con CHX durante la edad adulta tardía (días 40 a 50) y durante toda la vida adulta (Fig. 1c). De acuerdo con estudios anteriores, el tratamiento con CHX durante toda la vida adulta prolongó significativamente la esperanza de vida. Sorprendentemente, el tratamiento con CHX solo durante los primeros 10 días de la vida adulta produjo una extensión similar de la vida útil (Fig. 1d). Sin embargo, el tratamiento con CHX en una etapa avanzada de la vida no extendió la esperanza de vida (Fig. 1d, Fig. Suplementaria 1b). Estos resultados sugieren que la elevación transitoria del PT en la edad adulta temprana puede ser un factor importante del envejecimiento.

un PT entre edades, determinado por la incorporación (izquierda) de 35S-metionina normalizada al contenido de proteínas (n = 3) y la incorporación (centro) de puromicina normalizada a la tinción de Ponceau (n = 3). Los análisis comparan el PT con respecto al día 2; ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Dunnett. (Derecha) Ensayo de PT in vitro con reportero de ARNm de luciferasa y extractos de mosca. La pendiente de la parte lineal de la curva de actividad de la luciferasa se utiliza para calcular la tasa de PT. n = 12/grupo; ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey. b PT de la edad adulta temprana después de CHX ± 1 µM (día 0 a 10), determinado mediante la incorporación de puromicina normalizada a la tinción de Ponceau. n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. c Esquema experimental para manipular transitoriamente PT en diferentes etapas de la vida; Ciclohexamida (CHX) 1 µM administrada a moscas w1118 durante la edad adulta temprana (día 0 a 10), la edad adulta tardía (día 40 a 50) o la edad adulta completa. d La CHX en la edad adulta temprana (días 0 a 10) prolonga la esperanza de vida al igual que la CHX en toda la edad adulta. La CHX en la edad adulta tardía (días 40 a 50) no altera la esperanza de vida. Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. e La CHX en la edad adulta temprana (días 0 a 10) reduce los déficits relacionados con la edad en la actividad espontánea. Jóvenes=día 12, viejos=día 50. n = 200/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. f La CHX en la edad adulta temprana (días 0 a 10) reduce los déficits cognitivos relacionados con la edad en el entrenamiento de aversión al olfato. Jóvenes=día 12, viejos=día 50. n = 200/grupo; Prueba de chi-cuadrado. g La CHX en la edad adulta temprana (días 0 a 10) previene los déficits relacionados con la edad en la integridad de la barrera intestinal en los ensayos de los Pitufos. n = 250/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. h (Izquierda) imágenes representativas de huevos puestos en viales después de tratamientos con CHX durante la edad adulta temprana (día 0 a 10). (Derecha) La CHX en la edad adulta temprana perjudica la producción de óvulos a edades tempranas, retrasa el pico de fertilidad y mejora la producción de óvulos en edades avanzadas. n = 100/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. Los datos se muestran como media ± DE. Los datos femeninos para ensayos de PT y ensayos de salud se muestran aquí. Datos masculinos en la figura complementaria 1. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La esperanza de vida también mejoró considerablemente después de prevenir la elevación del PT en la edad adulta temprana. Para ambos sexos, el tratamiento con CHX en la edad adulta temprana abolió la disminución normal relacionada con la edad en la actividad espontánea (Fig. 1e femenina, Fig. 1c complementaria masculina) y el aprendizaje y la memoria (Fig. 1f femenina, Fig. 1d complementaria masculina). La función cognitiva se evaluó en moscas con un paradigma de entrenamiento de aversión olfativa bien establecido, donde se entrena a las moscas para asociar un olor particular con una sensación negativa (descarga eléctrica)18. Confirmamos que este resultado no fue un artefacto del tratamiento con CHX en la vida temprana que afectó las respuestas sensoriomotoras a los olores y las descargas eléctricas en la vejez (Figura complementaria 1f). Además evaluamos la salud intestinal, específicamente la función de la barrera intestinal, con el llamado ensayo "Pitufo"19. Aquí, las moscas fueron alimentadas con tinte azul no absorbible y la pérdida de integridad de la barrera intestinal se detectó contando el número de moscas que exhibían tinte azul fuera del tracto digestivo y en todo el cuerpo (denominados "Pitufos"). El tratamiento con CHX en los primeros años de vida evitó por completo los aumentos dependientes de la edad en los Pitufos y mejoró drásticamente la integridad de la barrera intestinal en edades avanzadas en ambos sexos (Fig. 1g femenina, Fig. Suplementaria 1e masculina). El tratamiento con CHX en los primeros años de vida también previno la senescencia reproductiva y mejoró significativamente la producción de huevos en edades avanzadas (Fig. 1h); sin embargo, la producción de óvulos a principios de la edad adulta se vio afectada y el pico de fertilidad se retrasó. Estos resultados implican una posible compensación entre la fecundidad en la edad adulta temprana y la salud y la longevidad posteriores. Como se observó anteriormente en líneas seleccionadas para sobrevivir y reproducirse a edades tardías20, la reproducción en las primeras etapas de la vida se reduce mientras que la reproducción en las últimas etapas de la vida aumenta. Aún así, la producción total de huevos durante toda la vida no se vio afectada significativamente (Figura complementaria 1h). En conjunto, nuestros datos indican que la elevación del PT en la edad adulta temprana, aunque es beneficiosa para maximizar la fecundidad en las primeras etapas de la vida, ejerce impactos negativos duraderos en las trayectorias de envejecimiento en la vejez.

La quinasa ribosómica S6 (S6K) promueve la PT mediante la fosforilación/activación de la maquinaria traslacional21. Planteó la hipótesis de que durante la elevación del PT en la edad adulta temprana, aumentará la fosforilación de S6K. Por lo tanto, sobreexpresamos una forma dominante negativa / quinasa muerta de S6K (S6KKQ) 22 durante la edad adulta temprana mediante el uso del sistema GeneSwitch (expresión inducible por RU486), que bloqueó por completo el aumento temprano en PT (Fig. 2a, b). Los resultados fueron notablemente similares a nuestros experimentos CHX. La sobreexpresión de S6KKQ en la edad adulta temprana aumentó la esperanza de vida en un grado similar a la sobreexpresión de S6KKQ en toda la edad adulta (Fig. 2c). Además, la sobreexpresión de S6KKQ en la edad adulta temprana también mejoró la actividad locomotora, la función cognitiva, la integridad de la barrera intestinal y el rendimiento reproductivo en edades avanzadas en ambos sexos (Figuras complementarias 2a-g, i, j). Sin embargo, al igual que con nuestros tratamientos con CHX, la sobreexpresión de S6KKQ en la edad adulta tardía no alteró significativamente la esperanza de vida (Fig. 2c, Fig. Suplementaria 2k). El agente inductor RU486 no afectó nuestros criterios de valoración experimentales. Específicamente, RU486 en sí no alteró significativamente la esperanza de vida en ninguna etapa adulta en moscas GeneSwitch GAL4 (daGS)>w1118 (control) sin hijas (Figura complementaria 2l). Además, para daGS> w1118, RU486 no afectó significativamente la producción de huevos en todas las edades (Figura complementaria 2h), lo que indica que RU486 en sí no retrasó el pico de fertilidad ni mejoró la aptitud reproductiva en edades avanzadas.

a PT de edad adulta temprana en moscas daGS> UAS-S6KKQ después de ± 200 µM RU486 (día 0-10), determinado mediante la incorporación de puromicina normalizada a la tinción de Ponceau. n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Sidak. b Esquema experimental para manipular transitoriamente PT en diferentes etapas de la vida; Se administraron 200 µM de RU486 a moscas GeneSwitch GAL4 (daGS)>UAS-S6KKQ sin hijas durante la edad adulta temprana (día 0 a 10), la edad adulta tardía (día 40 a 50) o la edad adulta completa. c En las moscas daGS > UAS-S6KKQ, el RU486 de edad adulta temprana (día 0 a 10) prolonga la vida útil al igual que el RU486 de edad adulta completa. El RU486 en la edad adulta tardía (días 40 a 50) no altera la esperanza de vida. Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. Incorporación de puromicina en (d), chico homocigotos (hembra) y (e), chico heterocigotos (hembra) versus tipos salvajes. Ausencia de elevación del PT en la edad adulta temprana en chicos homocigotos y chicos heterocigotos. n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Sidak. Datos masculinos en la figura complementaria 1. f Esquema experimental para inducir la elevación de PT en la edad adulta temprana en chicos homocigotos; ± 200 µM RU486 administrado a chico1/chico1, UAS-S6KTE; tubulina-GeneSwitch (tubGS) GAL4 vuela durante la edad adulta temprana (día 0 a 4). g Incorporación de puromicina en chico1/chico1, UAS-S6KTE; moscas tubGS GAL4 (± RU486, día 0–4). n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Sidak. h La sobreexpresión de S6KTE en la edad adulta temprana acorta la esperanza de vida y suprime en gran medida la longevidad de los homocigotos chico. chico vuela sin inducciones S6KTE en la edad adulta temprana versus controles. Mujeres: + 34,4%, hombres: + 37,7% (cambio porcentual en la mediana de vida); chico vuela con inducciones S6KTE en la edad adulta temprana versus controles. Mujeres: + 6,3%, hombres: + 8,2%. La sobreexpresión de S6KTE en la edad adulta temprana no altera significativamente la vida útil de los controles +/+. Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. Los datos se muestran como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para confirmar aún más que nuestros hallazgos no se deben a efectos fuera del objetivo de CHX, utilizamos diazaborina (DAB) como nuestro tercer método para prevenir la elevación del PT en la edad adulta temprana (Figuras complementarias 1i, j). Se sabe que DAB reprime el PT al bloquear la maduración del ARNr y la biogénesis ribosómica8,23. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores, el tratamiento con DAB en la edad adulta temprana aumentó significativamente la esperanza de vida en un grado similar al del tratamiento de por vida, sin efectos de longevidad en el tratamiento en la vejez (Figura complementaria 1k).

Los beneficios en términos de vida y salud derivados del bloqueo de la elevación del PT en la edad adulta temprana no se debieron a la restricción dietética. Ni el tratamiento con CHX en los primeros años de vida ni la sobreexpresión de S6KKQ en los primeros años de vida tuvieron efectos significativos sobre la ingesta de alimentos y el almacenamiento de triglicéridos/glucógeno en todas las edades (Figura complementaria 3d-i). Las intervenciones en la edad adulta temprana tampoco tuvieron impactos significativos en el tamaño corporal y el tamaño de los órganos internos, como los músculos, el intestino o la grasa corporal (Figuras complementarias 3a-c). A diferencia de los machos, las hembras tratadas con CHX/RU486 en una etapa temprana de su vida tenían un peso corporal más bajo a pesar de no comer menos (Figura complementaria 3j, k), posiblemente debido a una producción deficiente de huevos durante la edad adulta temprana. Sin embargo, dado que el bloqueo del aumento temprano del PT prolongó considerablemente la esperanza de vida en ambos sexos y no solo en las mujeres, es poco probable que la reducción del peso corporal por sí sola sea un factor importante que contribuya a prolongar la esperanza de vida.

La señalización de insulina/IGF es una importante vía reguladora del crecimiento, cuya inhibición extiende considerablemente la esperanza de vida y retrasa las enfermedades relacionadas con la edad en múltiples especies animales24. Examinamos cómo se altera la dinámica de PT en moscas enanas con deficiencia de señalización de insulina/IGF (chico homocigotos). Se ha demostrado que las mutaciones en chico, el homólogo de Drosophila del sustrato del receptor de insulina de los vertebrados (IRS), prolongan la vida y la salud y protegen contra la neurodegeneración25,26,27. Los chicos homocigotos de larga vida de ambos sexos, a diferencia de sus homólogos de tipo salvaje, no mostraron la elevación de PT en la edad adulta temprana (Fig. 2d, Fig. Suplementaria 1l). Curiosamente, los chicos heterocigotos, que también son longevos pero no muestran fenotipos de enanismo observados en los chicos homocigotos25, tampoco mostraron la elevación del PT en la vida temprana (Fig. 2e, Fig. Suplementaria 1m). Por lo tanto, la pérdida de la elevación del PT en la edad adulta temprana en moscas chico de larga vida es independiente de los fenotipos enanos.

Para examinar si los homocigotos chico logran longevidad al prevenir el aumento de PT durante la edad adulta temprana, indujimos experimentalmente la elevación de PT en la vida temprana sobreexpresando transitoriamente formas constitutivamente activas de S6K (S6KTE)28 durante la edad adulta temprana (día 0-4). ) con RU486 (Fig. 2f). Sobreexpresamos S6K con una mutación fosfomimética T398E porque la fosforilación de S6K en T398 aumentó durante la edad adulta temprana (Fig. 3a) y fue crucial para la elevación del PT en la vida temprana. Inmediatamente después de la eliminación de RU486, el PT disminuyó y se restauró a niveles basales (Fig. 2g), lo que sugiere que pudimos manipular transitoriamente el PT para que se elevara solo durante el estrecho período de tiempo de la edad adulta temprana. Los homocigotos Chico tuvieron una esperanza de vida notablemente mejorada; sin embargo, la sobreexpresión de S6KTE durante solo 4 días acortó significativamente su vida útil a la de los controles y eliminó en gran medida sus beneficios de longevidad (Fig. 2h). Estos resultados sugieren que la pérdida de la elevación transitoria del PT en las primeras etapas de la vida es fundamental para el beneficio de longevidad de las moscas chico.

a Inmunotransferencias de fosfo-S6K y S6K. Actina se utilizó como control de carga. norte = 3; ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey. b Incorporación de puromicina en moscas daGS> UAS-S6KTE (± RU486 después del día 2). n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. c Plan experimental para bloquear la disminución del PT relacionada con la edad; 200 µM RU486, 200 µM RU486 + 1 µM CHX, o vehículo administrado a moscas GeneSwitch GAL4 (daGS)>UAS-S6KTE sin hijas después del día 2 (el pico PT). d La sobreexpresión de S6KTE después del día 2 acorta la esperanza de vida (: −41,8%, hombres: −45,6%; % de cambio en la esperanza de vida media), pero el tratamiento simultáneo con CHX restaura la esperanza de vida comparable a la de los controles. Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. e La sobreexpresión de S6KTE después del día 2 afecta la locomoción en el día 40. n = 200 mujeres/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. f La sobreexpresión de S6KTE después del día 2 causa defectos prematuros en la integridad de la barrera intestinal en los ensayos de Smurf. n = 250 mujeres/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. g La sobreexpresión de S6KTE después del día 2 afecta la cognición en el entrenamiento de aversión al olfato en el día 40. n = 200 mujeres/grupo; Prueba de chi-cuadrado. h (Izquierda) imágenes representativas de huevos puestos en viales el día 30 por moscas daGS > UAS-S6KTE y moscas daGS > w1118 (control) tratadas con ± RU486 después del día 2. (Centro) La sobreexpresión de S6KTE después del día 2 causa una mayor velocidad relacionada con la edad. Disminución de la producción de huevos. n = 100/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. (Derecha) Se calculó el área bajo la curva para determinar la producción de huevos durante toda la vida. La sobreexpresión de S6KTE después del día 2 afecta la producción de óvulos de por vida. Prueba t de Student de dos colas. Los datos se muestran como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. datos de salud masculina en la figura complementaria 4. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En conjunto, nuestros hallazgos sugieren fuertemente que la elevación del PT en la edad adulta temprana puede causar disminuciones funcionales relacionadas con la edad. Nuestra hipótesis es que la represión del PT que comienza después del día 2 es un proceso adaptativo para reducir la carga proteostática y frenar el deterioro funcional relacionado con la edad. Descubrimos que la fosforilación de S6K en T398 disminuye drásticamente después de alcanzar un pico en el día 2, manteniendo niveles basales bajos en el día 15 (Fig. 3a). Esto implica que la disminución del PT relacionada con la edad podría deberse a la pérdida de la fosforilación de S6K en T398. Por lo tanto, para evaluar nuestra hipótesis, evitamos la disminución del PT dependiente de la edad al sobreexpresar el S6KTE fosfomimético a partir del día 2. En las moscas de control, el PT disminuyó ~70 % en 15 días, pero las moscas que sobreexpresaban el S6KTE no redujeron significativamente el PT después el pico y mantuvo niveles altos de PT (Fig. 3b). La prevención de la caída del PT relacionada con la edad acortó la esperanza de vida en ~46% en ambos sexos (Fig. 3c, d). Sin embargo, volver a permitir que las moscas reduzcan el PT con la edad después de la edad adulta temprana y corregir la dinámica del PT mediante CHX (Fig. 3c, Fig. Suplementaria 4a) restableció completamente la vida útil al nivel de control (Fig. 3d). La incapacidad para suprimir el PT después de la edad adulta temprana también acortó significativamente la duración de la salud en ambos sexos. Incluso en la mediana edad, las moscas que sobreexpresan S6KTE después del pico de PT exhibieron deterioros en la actividad espontánea (Fig. 3e, Fig. 4b complementaria), la integridad intestinal (Fig. 3f, Fig. 4f complementaria), el aprendizaje y la memoria (Fig. 3g, Fig. 4f suplementaria). Fig. 4c-e), y los signos de envejecimiento reproductivo acelerado con la producción total de huevos disminuyeron en aproximadamente un 50% (Fig. 3h). Por el contrario, las moscas de control apenas mostraron deficiencias funcionales en este momento. En conjunto, nuestros datos sugieren que la disminución del PT relacionada con la edad puede no ser simplemente un subproducto pasivo del envejecimiento, sino potencialmente una respuesta adaptativa para maximizar el rendimiento reproductivo, frenar el deterioro funcional y promover un envejecimiento saludable.

La proteostasis se deteriora con la edad, provocando acumulaciones de proteínas mal plegadas y agregados de proteínas insolubles, que están muy implicados en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad29. Nuestra hipótesis es que el aumento repentino de PT en la edad adulta y la posterior sobrecarga de proteínas pueden abrumar la capacidad de plegamiento celular, facilitando el plegamiento incorrecto de las proteínas y alterando la proteostasis. Para examinar si la elevación del PT en la edad adulta temprana desencadena una disfunción proteostática dependiente de la edad, tratamos moscas con CHX durante la edad adulta temprana y evaluamos la acumulación de agregados de proteínas insolubles a lo largo de las edades. Sorprendentemente, el bloqueo transitorio de la elevación del PT en la edad adulta temprana evitó por completo la acumulación relacionada con la edad de proteínas ubiquitinadas insolubles (IUP) (Fig. 4a). Por el contrario, los homocigotos chico de larga vida, que mantienen un nivel constante de PT durante toda su vida, no mostraron signos de acumulación de IUP dependiente de la edad. Sin embargo, la inducción transitoria de la elevación de PT en la vida temprana provocó que los homocigotos chico exhibieran la acumulación de IUP relacionada con la edad al igual que los tipos salvajes (Fig. 4b). Esto es consistente con nuestro hallazgo anterior de que inducir el aumento de PT en la edad adulta temprana acortó la vida útil de los homocigotos chico a la de los controles. En conjunto, nuestros datos sugieren que el aumento transitorio del PT en la edad adulta temprana desencadena la acumulación de IUP en edades avanzadas.

Adultez temprana = día 0 a 10. a CHX 1 µM en la edad adulta temprana previene la acumulación relacionada con la edad de proteínas ubiquitinadas insolubles (IUP). n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. b No hay acumulación de IUP relacionada con la edad en homocigotos chico de larga vida. La sobreexpresión de S6KTE (días 0 a 4) provoca una acumulación de IUP relacionada con la edad en chicos homocigotos. n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. c Gráficos volcánicos de análisis proteómicos que comparan las fracciones solubles de Triton X-100 del día 2 con las moscas del día 0 (arriba) y las moscas del día 2 (±CHX, abajo). n = 8/grupo; Prueba t de Student de dos colas, FDR < 0,05. d Gráfico de volcán del análisis proteómico que compara las fracciones insolubles de Triton X-100 de las moscas del día 50 (± CHX (día 0-10)). n = 8/grupo; Prueba t de Student de dos colas, FDR < 0,05. e (Izquierda) Niveles de hormonas juveniles medidos mediante GC-MS normalizados a la masa húmeda en moscas del día 0 y moscas del día 2 tratadas con vehículo o CHX. norte = 25/grupo. (Derecha) CHX en la edad adulta temprana previene la acumulación de IUP en el día 50; sin embargo, CHX+Met (metopreno, 25 µg/ml) en la edad adulta temprana provoca la acumulación de IUP en el día 50, al igual que los controles. n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. f La Met en la edad adulta temprana (25 µg/mL) elimina en gran medida la longevidad mediada por CHX (mujeres: + 6,1% vs. + 36,7%, hombres: + 7,7% vs. + 34,6%; % de cambio en la esperanza de vida media, p < 0,0001) . La Met en la edad adulta temprana por sí sola acorta la esperanza de vida (p <0,0001), pero el efecto es menor que lo que observamos con el tratamiento simultáneo con CHX (análisis de riesgos proporcionales en la figura complementaria 6). Toda la edad adulta Met acorta la esperanza de vida (p <0,0001). Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. g, la extensión de la esperanza de vida en la CHX en la edad adulta temprana disminuye con la ablación de CA (corpora allata) (mujeres: + 7,9% frente a + 41,5%, hombres: + 9,7% frente a + 42,5%). Control 1=21 de agosto-GAL4 > w1118; Control 2 = w1118 > UAS-NiPp1; CA ablacionada=21Ago-GAL4 > UAS-NiPp1. Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. Análisis de riesgos proporcional en la figura complementaria 6. Los datos se muestran como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En particular, como se muestra en estudios anteriores de C. elegans, la mayoría de las proteínas que comprenden agregados de proteínas insolubles formados durante el envejecimiento son proteínas que se sabe que funcionan predominantemente en la edad adulta temprana30. Por lo tanto, en Drosophila, planteamos la hipótesis de que las proteínas propensas a la agregación sintetizadas en gran medida en la edad adulta temprana con un PT alto pueden desencadenar una disfunción proteostática dependiente de la edad. Para probar esta hipótesis e identificar proteínas candidatas propensas a la agregación, utilizamos cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización (LC/ESI-MS/MS). Examinamos cómo el bloqueo de la elevación temprana del PT afecta el proteoma sintetizado en la edad adulta temprana y, en consecuencia, los componentes de los agregados de proteínas insolubles en la vejez.

Durante la elevación temprana de la PT, se sintetizaron en gran medida grandes familias de proteínas de transferencia de lípidos (LLTP), como la vitelogenina (Vg) -1, 2 y la apolipoforina (apoLp), junto con proteínas importantes para el metabolismo de lípidos/carbohidratos, la generación de ATP y la reproducción. / gametogénesis (Fig. 4c, Datos complementarios 1). Las familias LLTP (proteínas de transferencia de lípidos conservadas en especies animales, incluidos los humanos) desempeñan funciones fundamentales en la reproducción y el metabolismo energético31. Mientras tanto, las proteínas características de los cuerpos grasos de las larvas, como las proteínas del suero de las larvas (LSP1-α, β, γ y LSP-2) y las proteínas del cuerpo graso (FBP-1,2), se redujeron significativamente (Fig. 4c, Datos complementarios 1 ). Estos resultados sugieren que la remodelación de las lipoproteínas ocurre durante la edad adulta temprana para facilitar la histólisis del cuerpo graso larvario mientras se desarrolla el cuerpo graso adulto donde se sintetizan los LLTP32,33. El tratamiento con CHX en la edad adulta temprana revirtió por completo esta remodelación de lipoproteínas, como se manifiesta por niveles reducidos de LLTP, niveles elevados sostenidos de LSP/FBP y un catabolismo lipídico significativamente afectado en el análisis de ontología genética (Fig. 4c, Datos complementarios 1, Figs. 5, 6a suplementarias). , b). El tratamiento con CHX en la edad adulta temprana provocó reducciones generalizadas en las proteínas insolubles en edades avanzadas, siendo los LLTP las proteínas con regulación negativa más significativa (Fig. 4d, Datos complementarios 1). Estos resultados muestran que los LLTP, propensos a agregarse en edades avanzadas, se sintetizan cada vez más cuando el PT está elevado en la edad adulta temprana, mientras que el tratamiento con CHX en la edad adulta temprana bloquea esto.

A diferencia de las fracciones insolubles, el tratamiento con CHX en los primeros años de vida no causó cambios dramáticos en el proteoma en las fracciones solubles en edades avanzadas, excepto por la regulación positiva de las proteínas que promueven la función de los músculos, el corazón y la desintoxicación (Figura complementaria 7a). Sin embargo, la sobreexpresión de estas proteínas no alteró significativamente la esperanza de vida (Figuras complementarias 7b-d), lo que sugiere que estas proteínas están reguladas positivamente como un subproducto en lugar de un impulsor del envejecimiento saludable.

Observamos que la hormona juvenil (JH), sintetizada principalmente en los cuerpos allata (CA), no solo promueve la histólisis del cuerpo graso larvario sino que también regula positivamente todas las familias de LLTP durante la edad adulta temprana33. Con MS/MS dirigida, encontramos que los niveles de JH aumentan significativamente desde el día 0 al día 2 cuando el PT aumenta notablemente (Fig. 4e). Este aumento en JH durante la PT elevada en la edad adulta temprana se evitó mediante el tratamiento con CHX en la edad adulta temprana. Para los homocigotos chico de larga vida sin elevación aparente de PT en la vida temprana (Fig. 2), JH se mantiene en niveles basales bajos en la edad adulta temprana34. Por lo tanto, investigamos si la elevación del PT en los primeros años de vida impulsa la disfunción proteostática y el deterioro funcional relacionado con la edad a través de JH. Sorprendentemente, después de los tratamientos con metopreno (Met; análogo de JH) durante la edad adulta temprana, el bloqueo de la elevación del PT en la vida temprana ya no produjo ningún beneficio en la proteostasis en edades avanzadas (Fig. 4e). Met en la edad adulta temprana también abolió en gran medida los beneficios de longevidad conferidos al bloquear la elevación del PT en la vida temprana (Fig. 4f; mujeres: + 6,1% vs. + 36,7%, hombres: + 7,7% vs. + 34,6%). El Met en la edad adulta temprana por sí solo también acortó la esperanza de vida, pero el análisis de riesgos proporcionales de dos factores mostró que el efecto era significativamente menor que lo que observamos bajo tratamientos simultáneos con CHX (Figura complementaria 6c). De manera similar, en condiciones de deficiencia de JH (ablación de CA)33, la extensión de la vida útil mediante el tratamiento con CHX en la edad adulta temprana disminuyó significativamente (Fig. 4g. Fig. complementaria 6d; mujeres: + 7,9% frente a + 41,5%, hombres: + 9,7 % frente a + 42,5%). En conjunto, estos datos sugieren que la elevación temprana del PT desencadena una disfunción proteostática dependiente de la edad e impulsa el envejecimiento principalmente a través de JH.

La mejora del recambio de proteínas mediante la degradación proteasómica puede mejorar la proteostasis y la esperanza de vida35. El bloqueo de la elevación del PT en los primeros años de vida ralentizó la disminución de la actividad del proteasoma relacionada con la edad en un 58% (Figura complementaria 7e). Esto puede deberse a una regulación positiva traslacional selectiva de las subunidades del proteasoma 36 o ensamblajes de proteasoma mejorados al evitar que las subunidades del proteasoma/maquinaria generadora de ATP queden atrapadas en fracciones insolubles (Figura complementaria 6e). Sin embargo, basándose en el profundo impacto de la JH en los primeros años de vida sobre la proteostasis, decidimos centrarnos en la señalización de JH.

A continuación, examinamos si los LLTP sintetizados en gran medida durante la elevación del PT en la edad adulta temprana son impulsores de disminuciones relacionadas con la edad y disfunción proteostática en la vejez. Después de la sobreexpresión de apoLp durante la edad adulta temprana, el tratamiento con CHX ya no produjo ningún beneficio en la proteostasis en edades avanzadas (Fig. 5a, Fig. Suplementaria 7f). Del mismo modo, los beneficios de longevidad conferidos por el tratamiento con CHX en la vida temprana fueron abolidos en gran medida después de la sobreexpresión de apoLp durante la edad adulta temprana (Fig. 5b; mujeres: + 10,9% frente a + 45,5%, hombres: + 8,2% frente a + 44,3%). La sobreexpresión de apoLp en la edad adulta temprana por sí sola también acortó la vida útil, pero el análisis de riesgos proporcionales mostró que el efecto era significativamente menor que lo que observamos con tratamientos simultáneos con CHX (Figura complementaria 7g). De manera similar, la sobreexpresión de Vg en la edad adulta temprana eliminó sustancialmente las mejoras en la proteostasis/vida útil causadas por el bloqueo del aumento temprano del PT (Fig. 5c, d, Fig. complementaria 7f, g). Además, la eliminación de Vg y apoLp durante la edad adulta temprana prolongó significativamente la vida útil en las moscas de control, pero no en las moscas tratadas con tratamiento CHX en las primeras etapas de la vida (Figuras complementarias 7h-j). Estos datos sugieren que la elevación del PT en la edad adulta temprana desencadena una disfunción proteostática dependiente de la edad e impulsa el envejecimiento principalmente a través de LLTP propensos a la agregación.

Todos los tratamientos se limitan a la edad adulta temprana (días 0 a 10), a menos que se indique lo contrario. a La sobreexpresión de apoLp en la edad adulta temprana suprime las mejoras proteostáticas mediadas por CHX en el día 50. b La sobreexpresión de apoLp en la edad adulta temprana suprime en gran medida la longevidad mediada por CHX (mujeres: + 10,9 % frente a + 45,5 %, hombres: + 8,2 % frente a + 44,3 % ,p<0,0001). La sobreexpresión de apoLp en la edad adulta temprana por sí sola acorta la vida útil (p <0,0001), pero el efecto es menor de lo que observamos bajo CHX simultáneo (análisis de riesgos proporcionales en la figura complementaria 7). c La sobreexpresión de Vg-1 en la edad adulta temprana suprime en gran medida las mejoras proteostáticas mediadas por CHX en el día 50. d La sobreexpresión de Vg-1 en la edad adulta temprana suprime en gran medida la longevidad mediada por CHX (mujeres: + 9,6 % frente a + 28,8 %, hombres: + 7,4 % vs. + 27,9%, p < 0,0001). La sobreexpresión de Vg-1 en la edad adulta temprana por sí sola acorta la esperanza de vida (p <0,0001), pero el efecto es menor que lo que observamos bajo CHX simultáneo (análisis de riesgos proporcionales en la figura complementaria 7). e La Met para la edad adulta temprana (metopreno, 25 µg/ml) suprime las mejoras proteostáticas mediadas por CHX en el día 50; sin embargo, la caída simultánea de apoLp durante la edad adulta temprana restaura las mejoras proteostáticas mediadas por CHX en el día 50. f El cumplimiento de la apoLp en la edad adulta temprana elimina en gran medida la longevidad mediada por CHX (p < 0,0001); sin embargo, la caída simultánea de apoLp durante la edad adulta temprana restaura en gran medida la longevidad (p <0,0001). g Met en la edad adulta temprana suprime las mejoras proteostáticas mediadas por CHX en el día 50; sin embargo, la caída simultánea de Vg-1 durante la edad adulta temprana restaura las mejoras proteostáticas mediadas por CHX en el día 50. h La Met en la edad adulta temprana suprime en gran medida la longevidad mediada por CHX (p <0,0001); sin embargo, la caída simultánea de Vg-1 durante la edad adulta temprana restaura en gran medida la longevidad (p <0,0001). Inmunotransferencias: n = 3/grupo; ANOVA de dos vías con corrección de Sidak. Experimentos de duración de vida: n = 250/grupo (cada sexo); prueba de rango logarítmico. Los datos se muestran como media ± DE. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar si los LLTP son objetivos posteriores de JH en la mediación de la disfunción proteostática/envejecimiento dependiente de la edad, eliminamos los LLTP mientras tratamos moscas con CHX y Met durante la edad adulta temprana (Figura complementaria 7f). Como se demostró anteriormente, después de los tratamientos con Met en la edad adulta temprana, CHX ya no produjo ningún beneficio en la proteostasis en edades avanzadas; sin embargo, la caída simultánea de apoLp durante la edad adulta temprana volvió a permitir que las moscas tuvieran una proteostasis mejorada en edades avanzadas y evitó acumulaciones de IUP relacionadas con la edad (Fig. 5e). De manera similar, aunque Met en la edad adulta temprana abolió en gran medida los beneficios de longevidad conferidos al bloquear la elevación de PT en la vida temprana, la caída simultánea de apoLp durante la edad adulta temprana restauró casi por completo los efectos de extensión de la vida útil (Fig. 5f). Observamos resultados similares después de la caída de Vg durante la edad adulta temprana (Fig. 5g, h). Estos resultados sugieren que durante el aumento del PT en la edad adulta temprana, la JH altera la proteostasis en la vejez y afecta negativamente la esperanza de vida futura, principalmente a través de los LLTP.

La maduración del cuerpo graso durante la edad adulta temprana requiere JH y es responsable de la producción de LLTP32,33. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que eliminar el aumento repentino de PT en las primeras etapas de la vida puede proporcionar beneficios de longevidad al inhibir principalmente la remodelación del cuerpo graso. Para probar esta hipótesis, reprimimos PT solo en el cuerpo graso sobreexpresando S6KKQ bajo el controlador específico del cuerpo graso (S106-GS)37. Esto produjo una reducción de ~ 90% en el PT en el cuerpo graso sin afectar otros tejidos (Figura complementaria 8a). Sin embargo, el tratamiento con CHX en la edad adulta temprana aún produjo una extensión significativa de la esperanza de vida en ambos sexos (Figura complementaria 8b). Probamos esto además mediante la ablación del cuerpo graso sobreexpresando Reaper (inductor de apoptosis) bajo el controlador del cuerpo graso. Incluso después de la ablación del cuerpo graso, la CHX durante la edad adulta temprana aún mejoró considerablemente la esperanza de vida en un grado similar (Figuras complementarias 8c, d). Repetimos estos experimentos con otro controlador específico del cuerpo gordo (S32-GS) 37 y obtuvimos resultados similares (Figura complementaria 8e, f). La CHX en la edad adulta temprana tampoco afectó significativamente la tinción con Oil Red O ni los niveles de triglicéridos de la grasa corporal (Figura complementaria 8g). Del mismo modo, inducir la elevación del PT en la edad adulta temprana en homocigotos chico no logró estimular el almacenamiento de grasa corporal, aunque fue suficiente para abolir sus beneficios de longevidad (Figura complementaria 8h). Estos resultados sugieren que los beneficios en longevidad derivados del bloqueo de la elevación del PT en la edad adulta temprana no pueden explicarse completamente sólo mediante la remodelación del cuerpo graso; Los tejidos distintos del cuerpo graso se ven afectados durante la elevación del PT en las primeras etapas de la vida para afectar las trayectorias de envejecimiento en etapas posteriores de la vida. Es de destacar que la grasa corporal no es la única fuente importante de LLTP; Los LLTP también se sintetizan predominantemente en células madre de la línea germinal (GSC), neuronas, glía, músculos cardíacos, nefrocitos, etc.38.

También demostramos que la CHX en la edad adulta temprana mejora la esperanza de vida no simplemente perjudicando las funciones reproductivas de las proteínas del cuerpo graso. Específicamente, aunque la sobreexpresión de LLTP durante la edad adulta temprana abolió en gran medida la longevidad mediada por CHX, no restauró la producción de óvulos deteriorada en la edad adulta temprana (Figura complementaria 8i, j). Esto sugiere que las propiedades propensas a la agregación de las proteínas del cuerpo graso, en lugar de sus funciones reproductivas, pueden ser clave para la regulación de la esperanza de vida.

Dado que la remodelación del cuerpo graso por sí sola no fue suficiente para explicar completamente los beneficios de longevidad conferidos por la represión de la elevación del PT en la vida temprana, investigamos mecanismos alternativos. La proliferación de GSC alcanza su punto máximo en la edad adulta temprana para aumentar la aptitud reproductiva en los primeros años de vida39. Nuestra hipótesis es que la elevación del PT en la edad adulta temprana afectaría a las GSC porque tenía efectos profundos en la producción de huevos en las primeras etapas de la vida. Curiosamente, en C. elegans, las GSC proliferativas hacen que las respuestas al estrés celular (CSR) disminuyan drásticamente al inicio de la madurez reproductiva durante la edad adulta temprana al silenciar epigenéticamente a Hsp70 y Hsp1640. De hecho, inhibir la proliferación de GSC o eliminar las GSC previene la caída precipitada de la CSR durante la edad adulta temprana, mejora la proteostasis en la vejez y mejora la esperanza de vida40,41,42,43. Por lo tanto, examinamos si la elevación del PT en la edad adulta temprana desencadena el silenciamiento de la RSE dependiente de GSC.

De acuerdo con estudios previos de C. elegans40, la resistencia al estrés por calor/oxidativo disminuyó drásticamente dentro de los 4 días posteriores a la edad adulta temprana en Drosophila, lo que se evitó por completo mediante la ablación de GSC42 (Figuras complementarias 9a, b). Sorprendentemente, al igual que con la ablación de GSC, la eliminación de la elevación temprana del PT en la vida temprana con CHX evitó por completo la fuerte caída en la resistencia al estrés durante la edad adulta temprana (Fig. 6a, b). Para examinar si la elevación temprana de PT remodela transcripcionalmente la resistencia al estrés, realizamos análisis de RNAseq en moscas +/− estrés oxidativo (paraquat [PQ]) +/− tratamiento con CHX en la edad adulta temprana. Observamos que el perfil transcripcional en respuesta a PQ cambió drásticamente del día 0 al día 10; sin embargo, después del tratamiento con CHX en la edad adulta temprana, el perfil transcripcional de las moscas del día 10 se volvió similar al de las moscas del día 0 (Fig. 6c). Las moscas del día 0, en respuesta a PQ, regulan positivamente genes CSR importantes para la resistencia al estrés oxidativo/calórico, la desintoxicación y el metabolismo xenobiótico, mientras que regulan negativamente genes importantes para la reproducción, el metabolismo del hierro y la formación de matriz extracelular (Fig. 6c, Fig. Suplementaria 10a, b). ). Sin embargo, las moscas del día 10, en respuesta a PQ, regulaban positivamente genes importantes para la reproducción y la formación de la matriz extracelular, mientras que regulaban negativamente los genes CSR (Fig. 6c, Fig. Suplementaria 11a, b). Después de bloquear la elevación temprana de PT con CHX, las moscas del día 10, similares a las moscas del día 0, regularon positivamente los genes CSR mientras que regulan negativamente genes importantes para la reproducción, el metabolismo del hierro y la formación de matriz extracelular (Fig. 6c, Fig. Suplementaria 12a, b). ). El tratamiento con CHX en la edad adulta temprana también reguló positivamente genes importantes para el plegamiento de proteínas y la remodelación de microtúbulos, mientras que reguló negativamente genes importantes para la apoptosis, las respuestas antibacterianas, el metabolismo de los fosfolípidos, etc.

El tratamiento con CHX (1 µM) en la edad adulta temprana previene la fuerte caída en (a), la resistencia al estrés oxidativo (p <0,0001) y b, la resistencia al estrés por calor (p <0,0001) durante la edad adulta temprana. Estrés oxidativo: paraquat 10 mM; Estrés por calor: 38 °C. Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. (c), (Izquierda) Mapa de calor de expresiones genéticas diferenciales por RNAseq después de 10 mM de paraquat en moscas del día 0 y moscas del día 10 tratadas con vehículo o CHX. norte = 8/grupo. FC = cambio de veces. (Derecha) Los 3 principales procesos biológicos de GO enriquecidos en genes que están regulados hacia arriba o hacia abajo después del paraquat en moscas del día 10 tratadas con vehículo o CHX. Los números blancos en los gráficos de barras indican un enriquecimiento multiplicado. CHX en la edad adulta temprana mejora (d), las inducciones de Sod-1 en respuesta a 10 mM de paraquat y (e), las inducciones de Hsp-22/Hsp-23 en respuesta a 38 °C en moscas intactas con células madre de línea germinal (GSC), pero no en moscas sin GSC. Control 1 = w1118 > UAS-bam; Control 2 = NGT-GAL4 > w1118; GSC ablacionado=NGT-GAL4 > UAS-bam. n = 12/grupo; ANOVA de dos vías con prueba post-hoc de Sidak. f Extensión de la esperanza de vida al comienzo de la edad adulta (día 0 a 10) La CHX disminuye con la ablación de GSC (mujeres: +10,6 % frente a + 46,7 %, hombres: + 12,1 % frente a + 30,8 %). Cada sexo: n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. g La CHX en la edad adulta temprana mejora la esperanza de vida tanto en controles fértiles como en mutantes OvoD1 estériles. WT tipos salvajes. n = 250/grupo; prueba de rango logarítmico. h Modelo propuesto que describe los mecanismos por los cuales un PT elevado en la edad adulta temprana desencadena una disfunción proteostática e impulsa el envejecimiento. Los datos se muestran como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

De acuerdo con nuestros datos de RNAseq, bajo estrés oxidativo/calórico, la inducción de los genes sod-1, hsp-22 y hsp-23 se atenuó significativamente durante la edad adulta temprana; sin embargo, tanto la ablación de GSC como el bloqueo del aumento temprano de PT restauraron por completo la inducción de estos genes CSR (Fig. 6d, e, Fig. complementaria 9c, d). El tratamiento con CHX en los primeros años de vida parece mejorar la resistencia al estrés al inhibir el silenciamiento de los genes CSR dependiente de GSC. En apoyo de esto, el bloqueo de la elevación temprana de PT mejoró la resistencia al estrés y la inducción de genes CSR en moscas intactas con GSC, pero no en moscas sin GSC (Figuras complementarias 9a, b, Figuras 6d, e). Además, bloquear la elevación temprana del PT redujo significativamente la proliferación de GSC durante la edad adulta temprana (Figura complementaria 9e).

Luego investigamos si el aumento temprano del PT regula el envejecimiento a través de la señalización GSC. En moscas intactas con GSC, el bloqueo de la elevación temprana de PT mejoró considerablemente la esperanza de vida (Fig. 6f; hembra: + 41,5%, macho: + 42,5%). En moscas sin GSC, el tratamiento con CHX en sus primeras etapas de vida aún proporcionó un beneficio de longevidad, pero el tamaño de este beneficio es sustancialmente menor que el conferido en moscas con GSC intactas (Fig. 6f; hembra: + 7,9%, macho: + 9,7% ). Bloquear el aumento temprano del PT no mejoró la esperanza de vida simplemente induciendo esterilidad y aboliendo los costos de supervivencia de la producción de gametos. Demostramos que el tratamiento con CHX en la edad adulta temprana prolongó la vida útil en líneas mutantes estériles femeninas dominantes intactas con GSC (OvoD1) 44 de manera similar, bloqueando la elevación temprana en la vida temprana en PT prolongó significativamente la vida útil al igual que en entornos fértiles (Fig. 6g). Nuestros datos sugieren que la elevación del PT en la edad adulta temprana desencadena el silenciamiento transcripcional de los genes CSR e impulsa disminuciones relacionadas con el envejecimiento principalmente a través de la señalización GSC.

En conjunto, nuestro trabajo propone que la elevación transitoria de la edad adulta temprana en PT remodela la red de proteostasis de la vida posterior y altera las trayectorias de envejecimiento futuras a través de dos vías de señalización (Fig. 6h). Demostramos que la elevación del PT en la edad adulta temprana mejora la señalización de JH, que regula positivamente los LLTP, incluidas las vitelogeninas y las apolipoforinas. Estos LLTP propensos a la agregación ayudan con la reproducción pero desencadenan una disfunción proteostática en la vejez. Paralelamente, la elevación temprana del PT mejora la proliferación de GSC, que silencia transcripcionalmente los genes CSR que pueden ser potencialmente esenciales para el mantenimiento de la proteostasis. Proponemos que estas dos vías en conjunto pueden impulsar disminuciones funcionales relacionadas con la edad.

Demostramos que la elevación transitoria del PT durante la edad adulta temprana ejerce impactos negativos duraderos en las trayectorias de envejecimiento al desencadenar una disfunción proteostática en la vejez. Nuestros resultados sugieren que la rápida supresión del PT después de la edad adulta temprana puede ser fundamental para aliviar la carga proteostática en la vejez, ralentizar el deterioro funcional relacionado con la edad y mejorar la esperanza de vida y la salud. Nuestros estudios implican que el aumento y la caída del PT a lo largo del tiempo pueden afectar el envejecimiento en la dirección opuesta a lo que se suponía anteriormente.

Proponemos que la elevación temprana del TP en la vida representa un efecto pleiotrópico antagónico, que produce efectos beneficiosos en los adultos jóvenes pero, en última instancia, causa efectos nocivos en la vejez y conduce a la senescencia. Un PT alto en las primeras etapas de la vida puede promover la reproducción al estimular la proliferación de GSC y aumentar los niveles de LLTP a través de JH. La proliferación de GSC es esencial para la producción continua de gametos, y los LLTP son importantes para la maduración de espermatozoides y óvulos45,46,47. Sin embargo, al final de la edad adulta, los LLTP propensos a la agregación pueden desencadenar una disfunción proteostática. Además, las GSC en proliferación pueden aumentar la susceptibilidad al estrés proteostático al silenciar los genes CSR, que pueden contribuir al envejecimiento. Aunque identificamos que los LLTP y JH son moléculas clave sintetizadas durante la elevación del PT en las primeras etapas de la vida que pueden acelerar las disminuciones relacionadas con la edad, estos factores por sí solos no fueron responsables de todos los efectos de la longevidad.

Demostramos que los LLTP sintetizados en la edad adulta temprana desencadenan una disfunción proteostática dependiente de la edad; sin embargo, aún es necesario dilucidar el mecanismo molecular subyacente exacto. Los LLTP con estructuras de lámina β altamente enriquecidas pueden actuar como semillas para iniciar el plegamiento/agregación incorrectos de otras proteínas nativas o atrapar proteínas ya plegadas incorrectamente48. Alternativamente, los LLTP pueden asignar lípidos (fuentes de energía) a la línea germinal a costa de regular a la baja el mantenimiento/reparación en los tejidos somáticos. De hecho, los LLTP son esenciales para transportar lípidos desde los tejidos somáticos, principalmente los intestinos, hasta la línea germinal y apoyar la reproducción49. Curiosamente, después de la ablación de GSC, las reservas de lípidos intestinales ya no se agotan con la edad y se generan ácidos grasos monoinsaturados a partir de la descomposición del exceso de grasa, que actúan como señales lipídicas bioactivas para mejorar la proteostasis y la esperanza de vida50,51,52. Los estudios lipidómicos futuros ayudarán a determinar si los LLTP sintetizados en la edad adulta temprana alteran la partición/composiciones de los lípidos para remodelar la proteostasis en los tejidos somáticos.

La elevación del PT en la edad adulta temprana puede ser un factor de disminución relacionada con la edad en especies animales distintas de Drosophila. Por ejemplo, los gusanos mutantes daf-2 del receptor de insulina/IGF-1 de larga vida, similares a las moscas homocigotas chico, mantienen un PT bajo durante la edad adulta temprana, a diferencia de los tipos salvajes2. Además, el tratamiento transitorio de ratones enanos Ames de larga vida con hormona del crecimiento (GH) en la vida posnatal temprana abolió en gran medida su longevidad53,54. Dado que la GH es un factor endocrino importante que estimula el PT y aumenta bruscamente durante la edad adulta temprana en los mamíferos (incluidos los humanos)55, la GH puede regular la longevidad de los mamíferos modulando la elevación del PT en la edad adulta temprana. Los LLTP sintetizados durante la edad adulta temprana también pueden regular el deterioro relacionado con la edad en animales de orden superior. Los centenarios mostraron niveles bajos de LLTP, que se han asociado con un riesgo reducido de enfermedades metabólicas/cardiovasculares relacionadas con la edad y que alguna vez se propusieron como un síndrome de longevidad56,57,58. Se necesitan más estudios para determinar si la regulación de la longevidad por la elevación del PT en las primeras etapas de la vida se conserva en otras especies animales.

Nuestro trabajo sugiere que la disminución del PT relacionada con la edad es poco probable que sea un subproducto pasivo del envejecimiento, sino una respuesta adaptativa que maximiza el rendimiento reproductivo a lo largo de la vida y ralentiza las disminuciones funcionales relacionadas con la edad. El PT comienza a disminuir tan pronto como el día 2 después de la eclosión, alcanzando niveles basales bajos para el día 15. Las moscas todavía se reproducen activamente a estas edades con una producción máxima de huevos alrededor del día 10. Cuando bloqueamos la caída del PT relacionada con la edad, las moscas mostraron una esperanza de vida reducida y deterioros en la locomoción, las funciones cognitivas y la integridad de la barrera intestinal a edades más tempranas. También experimentaron un envejecimiento reproductivo acelerado con reducciones en la producción total de huevos de ~50%. Dado que la caída del PT relacionada con la edad ocurre antes del pico de fertilidad y puede tener impactos positivos en el resultado reproductivo, planteamos la hipótesis de que los animales están bajo selección activa para reprimir la traducción de proteínas para retrasar las disminuciones funcionales y extender su período reproductivo.

Nuestros hallazgos respaldan la opinión de que las trayectorias de salud y envejecimiento a largo plazo pueden modularse mediante cambios biológicos transitorios que ocurren en las primeras etapas de la vida. Este estudio proporciona un marco teórico para comprender cómo el aumento y la caída del PT determinan las trayectorias de envejecimiento. Nuestro trabajo también proporciona una base para investigaciones futuras, incluido si un PT elevado en la edad adulta temprana es un posible evento/marcador biológico temprano que impulsa enfermedades relacionadas con la edad.

chico1/chico1 fue proporcionado por el Dr. Marc Tatar; w1118 y Daughterless-GeneSwitch-GAL4 (daGS) fueron proporcionados por el Dr. Scott Pletcher; Tubulina-GeneSwitch-GAL4 (tubGS) fue proporcionada por el Dr. David Walker; La UAS-apoLp estuvo a cargo del Dr. Joaquim Culi; UAS-bam fue proporcionado por la Dra. Erika Bach; UAS-Stretchin-Mlck fue proporcionado por el Dr. Mark VanBerkum. El resto de líneas de moscas se obtuvieron del Bloomington Drosophila Stock Center y FlyORF. Las líneas ovoD1 y UAS/GAL4 se retrocruzaron con w1118 entre 8 y 10 veces. La expresión del transgén se confirmó mediante qRT-PCR. Todas las líneas de moscas se mantuvieron en una incubadora humidificada a 25 °C con ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Las moscas se desarrollaron en medios de crecimiento (CT) de agar-harina de maíz-dextrosa-levadura59 y se transfirieron a medios con 10% de azúcar/levadura (SY10) después de las eclosiones60. Se permitió que las moscas se aparearan durante 48 h, se separaron/clasificaron en hembras y machos, y se mantuvieron como sexos separados en viales SY10 (25 moscas/vial) a partir de ese momento. Para los ensayos de duración de vida, se utilizaron 10 viales/grupo para cada sexo. Cada 2 a 3 días, las moscas se transfirieron a medio SY10 fresco sin gasificación y se calificó la supervivencia. Se utilizó el software dLife61 para registrar la supervivencia y analizar la esperanza de vida media/máxima mediante análisis de rangos logarítmicos. Los viales se aleatorizaron en términos de posición de la bandeja y se semiciegaron para reducir los impactos del sesgo ambiental/investigador.

Antes de los desafíos de estrés, las moscas se trataron previamente con ciclohexamida 1 µM (CHX; ChemService)/agua (vehículo) disuelta en SY10 durante 4 o 10 días. Para los ensayos de resistencia al estrés oxidativo62, las moscas se transfirieron a viales que contenían media Kimwipe empapada en 1 ml de sacarosa al 5 % y paraquat 10 mM (Sigma). Las moscas se transfirieron a viales nuevos cada 8 h que contenían medio paraquat/sacarosa, y se puntuaron las moscas muertas después de cada transferencia. Para los ensayos de resistencia al estrés por calor63, las moscas se expusieron al calor (38 °C) sumergiendo viales en un baño de agua. La mortalidad se registró a intervalos de 30 minutos. Para ambos ensayos de resistencia al estrés, se utilizaron 10 viales (25 moscas cada uno)/grupo para cada sexo. Para qRT-PCR de genes de resistencia al estrés y RNAseq, las moscas se trataron con paraquat durante 12 h o se expusieron a 38 °C durante 1 h (n = 12/grupo para cada sexo).

Como anteriormente18, las moscas fueron expuestas (mediante una bomba de aire) alternadamente a 2 olores neutros (3-octanol [OCT] y 4-metilciclohexanol [MCT], dilución 1/10 en aceite mineral). El entrenamiento implicó 3 rondas de entrenamiento con alternancia de olores, 5 min por ronda y exposición a una descarga de 100 V 60 Hz con uno de los olores. Todos los tratamientos se realizaron con poca luz roja. El olor asociado con la descarga eléctrica se alternaba entre los viales. Después del entrenamiento, a las moscas se les dio 1 hora para recuperarse y luego se colocaron en un laberinto en T (laboratorios Celexplorer). Se bombeaban olores opuestos desde lados opuestos del laberinto. A las moscas se les permitió explorar el laberinto durante 2 minutos, después de lo cual se sellaron las secciones del laberinto y se anotó el número de moscas en cada cámara. Antes del entrenamiento, la preferencia por los olores naturales se determinó exponiendo las moscas a 2 olores durante 2 minutos. Luego, las moscas fueron atrapadas en sus respectivos brazos del laberinto en T, anestesiadas y contadas. Los resultados fueron evaluados mediante análisis de Chi-cuadrado. Para cada grupo se utilizaron N = 50 moscas x 4 viales/edad.

Como medidas de control, se determinaron las respuestas sensoriomotoras a los olores y las descargas eléctricas en una cohorte separada64. Las respuestas de evitación de olores se cuantificaron exponiendo moscas ingenuas a uno de los dos olores (OCT o MCT) frente al aire en el laberinto en T. La capacidad de sentir y escapar de una descarga eléctrica (reactividad a la descarga) se cuantificó en moscas ingenuas insertando rejillas electrificables en ambos brazos del laberinto en T, pero aplicando pulsos de descarga en un solo brazo del laberinto en T y permitiendo a las moscas elegir entre las dos opciones. dos brazos. Después de 2 minutos, se cerraron las puertas de la cámara y se contó el número de moscas en cada brazo. Para cada grupo se utilizaron N = 50 moscas x 4 viales.

Como se hizo anteriormente19, las moscas se envejecieron en medio SY10 normal hasta el día del ensayo de los Pitufos. El medio SY10 teñido se preparó añadiendo tinte azul n.° 1 (FD&C) a una concentración del 2,5 % (peso/vol). Las moscas se mantuvieron en medio teñido durante 9 h. Las moscas fueron calificadas como pitufos cuando se podía observar la coloración del tinte fuera del tracto digestivo. Para cada sexo se utilizaron N = 25 moscas x 10 viales/grupo.

La actividad espontánea se evaluó utilizando un monitor de actividad de Drosophila (Trikenetic). La actividad se registró en una incubadora humidificada a 25 °C con ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Se permitió que las moscas se aclimataran durante 8 h antes de la recolección de datos. Actividad total cuantificada por ciclo de 12 h y dividida por el número de moscas. Para cada sexo, n = 10 viales (20 moscas por vial).

La alimentación se midió en función del consumo/excreción de alimentos que contienen colorantes65. Se dispensó medio SY10 que contenía 1% p/v de tinte azul n.° 1 (FD&C) en tapas de plástico que se ajustaban a viales de plástico anchos. Después de la incubación a 25 °C durante 24 h, se retiraron las tapas de comida y las moscas. Las moscas se homogeneizaron en 1,5 ml de agua para recoger el tinte consumido. Luego se centrifugaron las muestras para eliminar los restos del sedimento. El tinte excretado por las moscas en las paredes de los viales (tinte del vial excretado, ExVial) se recogió añadiendo 3 ml de agua a los viales, seguido de agitación vorticial. La absorbancia de los colorantes INT y ExVial en extractos acuosos se determinó a 630 nm en un lector de placas (SpectraMax iD3). La absorbancia se convirtió en volúmenes de medio consumidos mediante interpolación a partir de una curva estándar. Se utilizaron extractos de moscas alimentadas con medios sin colorantes para controlar la absorbancia de fondo. Para cada sexo se utilizaron N = 15 moscas x 10 viales/grupo. Para medir el peso corporal, se trataron 10 moscas con CHX ± 1 µM (ChemService)/RU486 ± 200 µM (Cayman Chemical) durante 10 días, se recogieron con tubos Eppendorf de 1,5 ml prepesados ​​y se pesaron con una microbalanza de precisión. Para cada sexo se utilizaron 10 tubos/grupo.

Se aparearon 10 hembras y 10 machos durante 2 días después de las eclosiones. Luego, las hembras se separaron y mantuvieron como sexos separados en viales SY10 (n = 20 viales/grupo; 5 hembras/vial). La fecundidad se analizó como el número de huevos puestos por hembra en cada vial después de un período de 24 h a la edad indicada a lo largo de la vida, contados bajo un estereomicroscopio.

La tinción con BrdU se realizó como se describió anteriormente en la ref. 66. Se diseccionaron y separaron ovarios de moscas tratadas con CHX 1 µM/vehículo (día 0 a 5) en orden alterno en medio de Grace (Lonza) y se incubaron en el mismo medio que contenía BrdU (1 mg/ml, Sigma) a 25ºC durante 1h. Después de 3 lavados con PBT (NaH2PO4/Na2HPO4 10 mM, NaCl 175 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%), los ovarios se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Después de bloquear con suero de cabra normal al 5% en PBT durante una hora, se agregaron anticuerpos primarios y secundarios. Los anticuerpos utilizados fueron: anti-BrdU de ratón (G3G4, DSHB, 1:50), anti-Vasa de rata (un regalo del Dr. Paul Lasko; 1:50), anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 568- Anticuerpos secundarios conjugados de cabra anti-rata (Thermo Scientific, 1:300). Las muestras se montaron en Vectashield con DAPI (Vector Laboratory) y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Carl Zeiss LSM 700. Para el análisis de colocalización, se utilizó el complemento JACoP de ImageJ. Después de ajustar el umbral en diferentes canales, se obtuvo el % de área de colocalización.

Como se hizo anteriormente67, las moscas se homogeneizaron en 500 µl de PBST (0,05% (v/v) Tween 20 en PBS) utilizando un mezclador con motor de mortero de plástico. Se incubaron 200 µl de lisado a 70 °C durante 5 minutos, se enfriaron en hielo y se incubaron con 1 µl de lipoproteína lipasa de 25 KU/ml de Chromobacterium viscosum (Calbiochem) a 37 °C durante la noche. Los residuos se eliminaron mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 3 min. El contenido de triglicéridos se determinó mezclando 15 µl del sobrenadante con 150 µl de reactivo de glicerol libre (Sigma), incubando a 37 °C durante 6 minutos y midiendo la absorbancia a 540 nm. El contenido de triglicéridos se normalizó a los niveles de proteína total medidos mediante el ensayo de Bradford a 595 nm. Para medir los niveles de triglicéridos en el cuerpo graso, se diseccionaron moscas en PBST frío y los cuerpos grasos recolectados se procesaron con los mismos procedimientos descritos anteriormente. Para determinar los niveles de glucógeno, se trataron 30 µl del sobrenadante (después del tratamiento con lipoproteína lipasa) con 14 unidades de amiloglucosidasa (Sigma) a 50 °C durante 1 h. Se combinaron 15 µl de la mezcla tratada con 150 µl de reactivo de glucosa (Sigma), se incubaron a 37 °C durante 30 minutos y se midió la absorbancia a 340 nm. El contenido de glucógeno también se normalizó con respecto a la proteína total. Se utilizaron triplicados de 10 moscas/grupo de edad.

Como se hizo anteriormente68,69, los cuerpos/carcasas grasas intactas se diseccionaron en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos, luego se lavaron 3 veces con PBS, se incubaron durante 20 minutos en una solución fresca de Oil Red O (6 ml de Oil Red O al 0,1%). O en isopropanol y 4 ml de agua destilada y se pasó a través de una jeringa de 0,45 µM), seguido de enjuague con agua destilada. Las muestras se montaron en Vectashield con DAPI (Vector Laboratory) y se tomaron imágenes mediante microscopía óptica. La tinción fue cuantificada por Image J.

Como se hizo anteriormente70, las moscas envejecidas en medio SY10 regular se colocaron y se incubaron en el medio SY10 suplementado con 2,5 µCi de 35S-metionina (American Radiolabeled Chemicals)/ml de alimento durante 24 h. Se congelaron 15 moscas y luego se molieron en 500 µL de SDS al 1% y se hirvieron durante 5 min. Luego las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 gy se aisló el sobrenadante. La proteína se precipitó con TCA al 5% y se mantuvo en hielo durante 1 h. Las muestras se centrifugaron a velocidad máxima durante 5 minutos y el sedimento se lavó dos veces con etanol al 95% enfriado con hielo. El sedimento se resuspendió en 100 µl de SDS al 1 % y el contenido de proteína se midió usando el ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). La radiactividad del 35S se midió mediante centelleo líquido (Beckman, Fullerton, CA). La incorporación de 35S se calculó normalizando los recuentos de 35S/min a los niveles de proteína total.

Como se hizo anteriormente17, las moscas envejecidas en medio SY10 regular se colocaron y se incubaron en el medio SY10 suplementado con puromicina 600 µM (Fisher Bioreagents) durante 24 h. Se congelaron 15 moscas y se molieron en 160 µl de tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa a 4 °C. El homogeneizado se centrifugó a velocidad máxima durante 15 min y se aisló el sobrenadante. El contenido de proteína del lisado se determinó utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Las muestras se mezclaron con tampón de muestra Laemmli suplementado con β-mercaptoetanol al 5% y se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos antes de la inmunotransferencia. Las muestras normalizadas se procesaron en geles SDS-10% PAGE, seguido de procedimientos estándar de transferencia Western. La carga de proteína total se visualizó mediante tinción con Ponceau S (Sigma). Se utilizaron anticuerpo anti-puromicina de ratón [3RH11] (Kerafast, 1:1000) y anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de cabra (IRDye 800CW, LI-COR, 1:5000). Las imágenes y la cuantificación se realizaron utilizando el sistema Odyssey (LI-COR) e Image J. Las tasas de traducción de proteínas se determinaron normalizando la incorporación de puromicina a la tinción de Ponceau.

Como se hizo anteriormente17, se homogeneizaron cuerpos enteros de moscas con un mortero de plástico en HEPES 10 mM (pH 7,4), DTT 5 mM y 1 cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche) y se centrifugaron a 14.000 g a 4 °C durante 15 min. Se agregaron 0,15 U/μl de nucleasa microcócica (New England BioLabs) y CaCl2 1 mM al sobrenadante y se incubaron a 20 °C durante 4 minutos, seguido de la adición de EGTA 2 mM. Las mezclas de reacción de traducción contenían extracto al 40% (v/v), ARN de luciferasa 2 nM, mezcla de aminoácidos 100 µM (Promega), acetato de potasio 50 mM, acetato de magnesio 2,5 mM, espermidina 0,1 mM, 20 U de inhibidor de RNasa (Fisher). fosfato de creatina 20 mM (Roche Applied Science) y 80 ng/μl de creatina quinasa (Roche Applied Science). La mezcla se incubó a 26 °C en una placa SpectraMax iD3 midiendo la luminiscencia cada 5 minutos. Se utilizó la pendiente de la parte lineal de la curva de actividad de la luciferasa para calcular la tasa de traducción de proteínas in vitro.

Se homogeneizaron cuerpos enteros de 2 moscas (n = 12/grupo) con un mortero de plástico en 100 μl de tampón de proteasoma enfriado (Tris 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, pH 7,4). Luego, las muestras se agitaron y se centrifugaron a 21.000 g a 4 °C durante 15 min. En una placa negra de 96 pocillos, se agregaron 10 μl de sobrenadante a 80 μl de tampón de proteasoma suplementado con ATP 5 mM adicional para medir la actividad del proteasoma 26 S. Finalmente, se añadió a cada pocillo sustrato fluorogénico Suc-LLVY-AMC 50 μM en 10 μl de tampón de proteasoma para medir la actividad similar a la quimotripsina. La placa se incubó a 37 °C en un lector de placas SpectraMax iD3 durante 4 h con fluorescencia medida cada 10 min con excitación de 355 nm y lectura con emisión de 460 nm. La actividad proteasómica total por muestra se definió como el delta entre las mediciones iniciales y finales.

El ARN se aisló de moscas utilizando un método Trizol estándar con 2 animales enteros o 20 cabezas (n = 12/grupo). ARN cuantificado por NanoDrop. El ADNc se sintetizó utilizando el kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) por triplicado técnico, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las expresiones de los genes diana se midieron y normalizaron a Rp49. Los cebadores utilizados fueron Rp49: 5'-CGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' y 5'-AAACGCGGTTCTGCATGA-3'; Sod-1: 5'-GGACCGCACTTCAATCCGTA-3' y 5'-TGGAGTCGGTGATGTTGACC-3'; GstD-1: 5'-CGCGCCATCCAGGTGTATTT-3' y 5'-CTGGTACAGCGTTCCCATGT-3'; GstE-1: 5'-ATAATGGCACTTTCATCTGGGAC-3' y 5'-CACTGGCATCGAAAGAAGAGAC-3'; Catalasa: 5'-GATGCGCTTCCAATCAGTTG-3' y 5'-GCAGCAGGATAGGTCCTCG-3'; TrxR-1: 5'-TGGAGTCGGTGATGTTGACC-3' y 5'-GAAGGTCTGGGCGGTGATTG-3'; Hsp-22: 5'-GCCTCTCCTCGCCCTTTCAC-3' y 5'-TCCTCGGTAGCGCCACACTC-3'; Hsp-23: 5'-GGTGCCCTTCTATGAGCCCTACTAC-3' y 5'-CCATCCTTTCCGATTTTCGACAC-3'; Hsp-68: 5'-GAAGGCACTCAAGGACGCTAAAATG-3' y 5'-CTGAACCTTGGGAATACGAGTG-3'; Hsp-70: 5'-AGCCGTGCCAGGTTTG-3' y 5'-CGTTCGCCCTCATACA-3'; Stretchin-Mlck: 5'-TCACTGGCGGAGAACTGTTC-3' y 5'-CGGGTGCTTTCGTATCCAGT-3'; Pdh: 5'-ATAGCCAAGACCTTCGGTAACA-3' y 5'-GCACTCAGTGTGGAATTGATGAT-3'; apoLp: 5'-TTGGAATCCTAGCTTCTGTGCT-3' y 5'-AGTCATAGTAGTTGCCGGGTAT-3'; Vit-1: 5'-CAACTCCGTCAACCAGGCATT-3' y 5'-GACAGGTGGTAGACTTGCTGC-3'; Vit-2: 5'-GCACCCTTTGCGTTATGGC-3' y 5'-TAGAGCTTGTCCAAACAGCGTA-3'

Como se hizo anteriormente17, se prepararon y homogeneizaron 15 moscas/grupo de edad en 200 µl de tampón A (Tris-HCl 20 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, proteasa y fosfatasa 1X). Cócteles inhibidores [Fisher Scientific]). Los lisados ​​se agitaron y se centrifugaron a 21.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes representaron la fracción de proteína soluble en detergente. Los pellets se lavaron en 500 µl de tampón A, se agitaron y se centrifugaron a 21.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en 100 µl de tampón B (Tris-HCl 10 mM [pH 7,5], SDS al 2 %, cócteles inhibidores de proteasa y fosfatasa 1X), se sonicaron durante 1 min (pulsos de 6 x 10 s) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los extractos se aclararon mediante centrifugación a 500 g durante 10 minutos, produciendo fracciones insolubles en detergente. La concentración de proteína total en las fracciones extraídas se determinó mediante el ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL) y las muestras normalizadas se procesaron en geles SDS-10 % PAGE, seguido de un procedimiento de transferencia Western estándar. Los anticuerpos utilizados fueron: anticuerpo antiubiquitina de conejo (Cell Signaling, 1:1000), anticuerpo anti-β-actina de conejo (Cell Signaling, 1:1000) y anticuerpo policlonal IgG anti-conejo de cabra (IRDye 680RD, LI-COR, 1:5000). Las imágenes y la cuantificación se realizaron utilizando el sistema Odyssey (LI-COR) e ImageJ, y los niveles agregados se calcularon como señales de ubiquitina normalizadas por los niveles de actina.

El contenido total de hormona juvenil se cuantificó para cuerpos enteros de moscas del día 0 y moscas del día 2 tratadas con CHX ± 1 µM durante 2 días después de la eclosión. Para cada grupo, se recogieron 25 muestras, cada una de las cuales constaba de 75 moscas homogeneizadas en 1,5 ml de metanol de calidad HPLC al 90%. Muestras almacenadas a −80 °C hasta su análisis. JH se extrajo con soluciones cada vez más polares de hexano, se purificó en columna y se convirtió en un derivado de d3-metoxihidrina. El JH total se midió utilizando un método GC-MS establecido71,72, realizado en un GC Agilent serie 8890, equipado con una columna para GC ZB-Wax de 30 mx 0,25 mm (Phenomenex) y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 7000D acoplado. Los picos de las muestras se analizaron monitorizando m/z 76 y 225 para asegurar la especificidad para JHIII. La abundancia total de JHIII se calculó frente a una curva estándar y se normalizó a masas húmedas.

Se aislaron extractos de proteínas solubles/insolubles en detergente, como se describió anteriormente. Para cada edad, se utilizó n = 8/grupo (cada uno derivado de cuerpos enteros de 15 moscas hembra). El análisis proteómico se llevó a cabo como se mencionó anteriormente73 con cambios menores, en la sección 2.5 nLC-ESI-MS2 en ID de proteínas para GeLC. Todos los extractos de proteínas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific) y se diluyó una cantidad determinada de proteína por muestra a 35 µl utilizando el tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen). Luego, las proteínas se redujeron con DTT y se desnaturalizaron a 70 °C durante 10 minutos antes de cargar todo en geles Novex NuPAGE 10% Bis-Tris Protein (Invitrogen) y se separaron (35 minutos a 200 V constantes). Los geles se tiñeron durante la noche con Novex Colloidal Blue (Invitrogen). Después de la decoloración, cada carril se cortó en múltiples fracciones de PM (3 a 8 fracciones) y se equilibró en bicarbonato de amonio 100 mM (AmBc). Luego, cada tapón de gel se digirió durante la noche con tripsina dorada, grado de espectrometría de masas (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los extractos peptídicos se reconstituyeron en ácido fórmico (FA) al 0,1 %/ddH2O a 0,1 µg/µl.

Los digestos de péptidos (8 µl cada uno) se inyectaron en una pila de nHPLC 1260 Infinity (Agilent Technologies) y se separaron utilizando una columna C-18 de punta tirada de 75 micrones de diámetro interno x 15 cm (Jupiter C-18 300 Å, 5 micrones, Phenomenex). Este sistema funciona en línea con un espectrómetro de masas híbrido Thermo Orbitrap Velos Pro, equipado con una fuente de iones Nanospray FlexTM (Thermo Fisher Scientific), y todos los datos se recopilaron en modo CID. El nHPLC está configurado con fases móviles binarias que incluyen el disolvente A (0,1 % FA en ddH2O) y el disolvente B (0,1 % FA en 15 % ddH2O/85 % ACN), programados de la siguiente manera; 10 min a 5 % B (2 µL/ min, carga), 90 min a 5–40 % B (lineal: 0,5 nL/min, analizar), 5 min a 70 % B (2 µL/ min, lavado), 10 min @ 0% B (2 µL/min, equilibrar). Después del escaneo de iones originales (300–1200 m/z a 60 k de resolución), se recopilaron datos de fragmentación (MS2) en los 15 iones más intensos. Para escaneos dependientes de datos, la detección del estado de carga y la exclusión dinámica se habilitaron con un recuento de repeticiones de 2, una duración de repetición de 30 segundos y una duración de exclusión de 90 segundos.

Los archivos XCalibur RAW se recopilaron en modo perfil, se centraron y se convirtieron a MzXML usando ReAdW v. 3.5.1. Luego se crearon archivos mgf usando MzXML2Search (incluido en TPP v. 3.5) para todos los escaneos. Luego se buscaron los datos usando SEQUEST (Thermo Fisher Scientific), que está configurado para tres escisiones máximas perdidas, una ventana de masa precursora de 20 ppm, digestión con tripsina, modificación variable C @ 57.0293 y M @ 15.9949 como configuración base, con PTM adicionales. (por ejemplo: Phos, Ox, GlcNAc, etc.) que pueden aplicarse más adelante según se determine que son de importancia experimentalmente. Las búsquedas se realizaron con un subconjunto específico de especies de la base de datos UniProtKB.

La lista de ID de péptidos generada en función de los resultados de búsqueda de SEQUEST se filtró utilizando Scaffold (Protein Sciences, Portland Oregon). Scaffold filtra y agrupa todos los péptidos para generar y retener solo ID de alta confianza y generó recuentos espectrales normalizados (N-SC) en todas las muestras con el fin de realizar una cuantificación relativa. Los valores de corte del filtro se establecieron con una longitud mínima de péptido de > 5 AA, sin estados de carga MH + 1, con probabilidades de péptido de > 80 % de CI y con un número de péptidos por proteína ≥ 2. Se establecieron las probabilidades de proteína a un IC > 99,0% y un FDR < 1,0. Scaffold incorpora los dos métodos más comunes para la validación estadística de grandes conjuntos de datos de proteomas, la tasa de descubrimiento falso (FDR) y la probabilidad de proteínas74,75,76. Luego se realizó la cuantificación relativa entre experimentos mediante conteo espectral77,78 y, cuando fue relevante, las abundancias de conteo espectral se normalizaron entre muestras79.

Las asignaciones de ontología genética y el análisis de rutas se llevaron a cabo utilizando MetaCore (GeneGO Inc., St. Joseph, MI). Las interacciones identificadas dentro de MetaCore se correlacionan manualmente mediante artículos de texto completo. Los algoritmos detallados se han descrito previamente en las referencias. 80,81. Para los datos proteómicos generados, se realizaron dos análisis estadísticos no paramétricos separados entre cada comparación por pares. Estos análisis no paramétricos incluyen 1) el cálculo de los valores de peso mediante análisis de significancia de microarrays (SAM; corte >|0,8| combinado con, 2) Prueba T (dos colas, varianza desigual, corte de p <0,05), que luego se clasifican según la mayor relevancia estadística en cada comparación. Para SAM82,83, donde el valor de peso (W) es una función derivada estadísticamente que se acerca a la significación a medida que aumenta la distancia entre las medias (μ1-μ2) para cada grupo y la DE (δ1-δ2) disminuye usando la fórmula, W = (μ1-μ2)/(δ1-δ2). Para las proporciones de abundancia de proteínas determinadas con N-SC, establecimos un cambio de 1,5 a 2,0 veces como umbral de significancia, determinado empíricamente analizando los datos del cuartil interno de los experimentos de control utilizando gráficos ln-ln, donde el coeficiente de correlación de Pierson (R ) es 0,98, y > 99% de las intensidades normalizadas cayeron entre el cambio de veces establecido. En cada caso, las tres pruebas (SAM, prueba T o cambio de pliegue) deben pasar para que se consideren significativas.

Para realizar los análisis estadísticos se utilizó el paquete de software Prism (Graphpad Software 8) y el paquete de software Microsoft Office 2016 Excel. Para todos los análisis estadísticos, se aceptó como estadísticamente significativo un p bilateral < 0,05. Todos los análisis se ajustaron para comparaciones múltiples. En las figuras, leyendas de figuras y métodos respectivos se proporciona información detallada sobre pruebas estadísticas, valores p y números n/N.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos proteómicos generados en este estudio se depositaron en la base de datos PRIDE con el código de acceso PXD044118, https://doi.org/10.6019/PXD044118. Los datos de RNAseq generados en este estudio se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus con el código de acceso GSE239506. Todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en los archivos del artículo y de información complementaria y del autor correspondiente previa solicitud. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Marc Tatar, Scott Pletcher, David Walker, Erika Bach, Joaquim Culi, Mark VanBerkum, Bloomington Drosophila Stock Center y FlyORF por las existencias de moscas. Agradecemos a Paul Lasko por proporcionarnos anticuerpos. Esta investigación fue apoyada por NIA/NIH R56-AG061051 y RF1 AG065301 (AP), Fundación Glenn para la Investigación Médica, (AP), Becas de la Federación Estadounidense para la Investigación del Envejecimiento (AFAR) para profesores jóvenes (AP), Premio Voelcker para Jóvenes Investigadores (AP ), San Antonio Nathan Shock Center (AP), San Antonio Pepper Center (AP), Programa T32 del Barshop Institute sobre biología del envejecimiento NIA T32-AG021890 (HK, EM), Programa de formación de científicos médicos de la UAB NIH T32-GM008361 (HK) y el Programa de formación de científicos médicos del sur de Texas NIH T32-GM113896 (HK). Las imágenes de moscas se utilizaron bajo la licencia Creative Commons: “Características y rasgos: Figura 10” de OpenStax College, Biology, CC BY 4.0: https://openstax.org/books/biology/pages/12-2-characteristics-and -rasgos.

Centro de Neurodegeneración y Terapéutica Experimental, Departamento de Neurología, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, 35294, EE. UU.

Harper S. Kim, Danitra J. Parker, Madison M. Hardiman y Andrew M. Pickering

Programa de formación de científicos médicos, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, 35294, EE. UU.

Harper S. Kim

Instituto Barshop de Estudios sobre Longevidad y Envejecimiento, Universidad de Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, EE. UU.

Harper S. Kim, Erin Munkacsy, Nisi Jiang, Yidong Bai y Andrew M. Pickering

Programa de formación de científicos médicos, University of Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, EE. UU.

Harper S. Kim

Departamento de Biología Integrativa y Farmacología, Facultad de Medicina McGovern de UTHealth, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Danitra J. Parker y Andrew M. Pickering

Laboratorio biológico MDI, Bar Harbor, ME, 04672, EE. UU.

Aric N. Rogers

Departamento de Anatomía y Sistemas Celulares, Universidad de Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, EE. UU.

Yidongbai

Centro de Investigación Agrícola de Tierras Áridas del USDA-ARS, Maricopa, AZ, 85138, EE. UU.

Colin Brent

Departamento de Anestesiología y Medicina Perioperatoria, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, 35249, EE. UU.

James A Mobley

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Steven Austad

Nathan Shock Center, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL, 35294, EE. UU.

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Departamento de Medicina Molecular, Universidad de Texas Health San Antonio, San Antonio, TX, 78229, EE. UU.

Andrew M. Pickering

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HK realizó la mayoría de los experimentos, con la ayuda de DP, MH, EM, NJ, YB y AR; JM realizó LC/ESI-MS/MS y analizó datos proteómicos; CB realizó GC/MS para medir los niveles de hormona juvenil. HK, SA y AP diseñaron la investigación, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron una versión final de este manuscrito.

Correspondencia a Andrew M. Pickering.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Kim, HS, Parker, DJ, Hardiman, MM et al. El aumento en la traducción de proteínas en la edad adulta temprana impulsa el envejecimiento a través de la señalización de la línea germinal y la hormona juvenil. Nat Comuna 14, 5021 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40618-x

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Recibido: 17 de marzo de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 18 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40618-x

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