Descubrimiento y multimerización de la cruz.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13668 (2023) Citar este artículo

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Los coronavirus han sido el agente causante de tres epidemias y pandemias en las últimas dos décadas, incluida la actual pandemia de COVID-19. Es deseable una terapia de coronavirus ampliamente neutralizante no solo para prevenir y tratar el COVID-19, sino también para brindar protección a las poblaciones de alto riesgo contra futuros coronavirus emergentes. Como todos los coronavirus utilizan proteínas de pico en la superficie viral para ingresar a las células huésped, y estas proteínas de pico comparten secuencia y homología estructural, nos propusimos descubrir agentes biológicos de reacción cruzada que se dirigen a la proteína de pico para bloquear la entrada viral. A través de campañas de inmunización de llamas, hemos identificado anticuerpos de dominio único (VHH) que tienen reactividad cruzada contra múltiples coronavirus emergentes (SARS-CoV, SARS-CoV-2 y MERS). Es importante destacar que varios de estos anticuerpos muestran una potencia subnanomolar contra todos los virus similares al SARS, incluidas las variantes emergentes de CoV-2. Identificamos nueve epítopos distintos en la proteína de pico a la que se dirigen estos VHH. Además, al diseñar VHH dirigidos a epítopos distintos y conservados en formatos multivalentes, mejoramos significativamente sus potencias de neutralización en comparación con los cócteles de VHH correspondientes. Creemos que este enfoque es ideal para abordar tanto las variantes emergentes del SARS-CoV-2 durante la pandemia actual como las posibles pandemias futuras causadas por coronavirus similares al SARS.

Los coronavirus (CoV) son una gran familia de virus que infectan a numerosas especies, incluidos los humanos, y constan de cuatro géneros principales conocidos como alfa, beta, gamma y delta. La especie de CoV más importante, el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2), un beta-coronavirus que surgió en China en 2019, está provocando actualmente una pandemia que ha provocado más de 500 millones de casos y 15 millones de muertes en exceso en los últimos 3 años1. Otras cepas de CoV incluyen el SARS-CoV y el MERS, los cuales han provocado brotes más pequeños, pero significativos, con alta morbilidad y mortalidad.

Los coronavirus son virus de ARN monocatenario (ssRNA) con un genoma de gran tamaño y una tasa de mutación relativamente alta. Se ha demostrado que ocurren eventos de recombinación entre diferentes especies de CoV, lo que resulta en una mayor variabilidad genética2. Uno de los factores clave que impulsan la gran carga continua de enfermedad COVID-19 es la alta tasa observada de mutación del virus SARS-CoV-2, lo que resulta en la aparición y rápida propagación de nuevas variantes virales capaces de evadir las enfermedades naturales e inducidas por vacunas. respuestas inmunes del huésped. Con base en la secuenciación genómica sistemática de aislados clínicos de SARS-COV-2, se han identificado 12 grupos de linajes y 5 de ellos, Alfa (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1 ), Delta (B.1.617.2) y el recientemente identificado Omicron (B.1.1.529), han sido definidos como variantes preocupantes (COV) por la Organización Mundial de la Salud. La variante Omicron, que presenta más de 30 mutaciones en la proteína de pico viral, es actualmente la principal variante que circula a nivel mundial. Múltiples estudios han informado de la resistencia de la variante Omicron contra la neutralización por anticuerpos y suero dirigidos a la cepa de tipo salvaje (Wuhan), lo que afecta significativamente la eficacia protectora de las vacunas originales basadas en la cepa de Wuhan y los anticuerpos terapéuticos3,4,5,6. Las vacunas bivalentes de ARNm, incluida la cepa original de Wuhan y la cepa Omicron BA.4/5 que circula actualmente, estuvieron disponibles recientemente como vacunas de refuerzo; sin embargo, es posible que surjan nuevos COV y escapen nuevamente de la inmunidad inducida por estos refuerzos. Además, la amenaza de continuos derrames zoonóticos justifica el desarrollo de agentes antivirales ampliamente reactivos que podrían combatir los coronavirus con potencial pandémico en el futuro7.

Si bien la gran mayoría de los anticuerpos dirigidos a la proteína de pico del SARS-CoV-2 han sido inmunoglobulinas convencionales, también se han identificado varios dominios variables de cadena pesada (VHH) potentes de anticuerpos de dominio único (sdAb) derivados de camélidos que se dirigen al pico de CoV-2. reportado8,9,10. En la literatura se han identificado varios epítopos de reacción cruzada en la espiga, incluidos los epítopos de clase 3 y clase 4 en el dominio de unión al receptor (RBD), representados por S309 y CR3022, respectivamente11,12,13. Dado que los VHH son más pequeños en comparación con los anticuerpos convencionales (~ 15 kDa frente a ~ 150 kDa), tienen el potencial de unirse a epítopos conservados más pequeños compartidos entre diferentes coronavirus a los que los anticuerpos convencionales podrían no acceder. Además, se ha demostrado que los VHH poseen propiedades biofísicas favorables y su tamaño más pequeño también facilita la generación de construcciones multivalentes. En este trabajo, informamos el descubrimiento de múltiples VHH que se unen a distintos epítopos de reacción cruzada en la proteína de pico. Además, demostramos que las potencias de neutralización de los VHH multiméricos aumentan considerablemente en comparación con las formas monovalentes. La potencia mejorada y el potencial para proteger contra mutaciones de escape hacen que este enfoque sea valioso para abordar las variantes emergentes del SARS-CoV-2, así como los virus similares al SARS que puedan surgir en el futuro.

Utilizamos un enfoque de inmunización heterólogo para identificar VHH con amplia reactividad cruzada (Fig. 1A). Nuestra hipótesis es que las células B con reactividad cruzada se enriquecerían después de tres rondas de inmunizaciones con proteínas de pico relacionadas, pero no idénticas. Con ese fin, las llamas fueron inmunizadas primero con la proteína de pico del SARS-CoV-2, seguida de proteínas de pico de los virus MERS y SARS-CoV con intervalos de tres semanas entre las inmunizaciones. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) 10 días después de la inmunización final. Se aislaron y cultivaron células B que se unían a la proteína de pico del SARS-CoV-2, y se utilizaron sobrenadantes para detectar la unión a las proteínas de pico de los tres virus. Se secuenciaron veintitrés clones que se unían a picos de SARS-CoV y SARS-CoV-2, se expresaron de forma recombinante en formatos monoméricos o bivalentes y se validaron para su unión mediante ELISA a proteínas de pico recombinantes solubles (Fig. 1B, Tabla S1). La unión de las construcciones bivalentes también se evaluó mediante citometría de flujo utilizando células que expresan de forma recombinante proteína de pico en su superficie (Tabla S2). Las 23 construcciones se unieron con afinidad similar al SARS-CoV y al SARS-CoV-2, observándose una mejora significativa de la afinidad en el formato bivalente, probablemente debido a una mayor avidez. Muchos VHH bivalentes mostraron afinidad por el pico del SARS-CoV-2, y la afinidad se mantuvo prácticamente sin cambios por las variantes Alfa, Beta, Gamma y Delta del SARS-CoV-2. Sin embargo, 8 de los candidatos perdieron la unión a las variantes BA.1 y BA.2 de Omicron (Tabla S1). Además, un VHH (6A1) también se unió a proteínas de pico de MERS y a los coronavirus beta humanos endémicos OC43 y HKU1 (Tabla S1). La medición directa de la afinidad contra la proteína de pico CoV-2 utilizando Biacore (Fig. 1C, Tabla S3) validó los resultados de ELISA. Se midieron las afinidades de resonancia de plasmón superficial (SPR) para VHH monovalentes. No se pudieron medir las afinidades monovalentes para las construcciones VHH-Fc debido a la avidez, por lo que los datos no se ajustan al modelo 1:1. Sin embargo, los sensogramas indican que las construcciones multivalentes tenían una unión mejorada. Se evaluó más a fondo la unión de los candidatos a diferentes dominios de la proteína de pico (RBD, NTD, S2) utilizando ELISA (resumido en la Fig. 1D). Utilizando este enfoque, pudimos identificar clones de doble reacción cruzada de SARS-CoV y SARS-CoV-2 dirigidos a los 3 dominios de la proteína de pico. Por el contrario, los clones con reacción cruzada triple que se unían a las tres proteínas de pico (SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS) estaban restringidos al dominio S2.

Identificación de VHH con reactividad cruzada después de la inmunización de llamas. (A) Esquema de inmunización de llamas utilizando proteínas de espiga purificadas de diferentes virus. (B) Resultados de unión de ELISA de VHH que muestran unión cruzada a las proteínas de pico del SARS-CoV y SARS-CoV-2 (panel izquierdo, monovalente; panel derecho, bivalente). (C) Sensogramas SPR de aglutinantes VHH seleccionados a la proteína de pico del SARS-CoV-2. Las curvas coloreadas son datos sin procesar a diferentes concentraciones de VHH; Las curvas negras se ajustan a un modelo 1:1. (D) Tabla de VHH de reacción cruzada dirigidas a diferentes dominios (RBD, NTD, S2) dentro de la proteína de pico. Se muestra la estructura de la proteína Spike (S) del SARS-CoV-2 (PDBID: 6XKL) y está coloreada por dominio; Dominio N-Terminal (NTD) en cian, Dominio de unión al receptor (RBD) en rosa, el dominio S2 en verde y el tramo entre el final del RBD y el comienzo del dominio S2 en color gris.

Inicialmente evaluamos la potencia de neutralización de los VHH candidatos en el formato bivalente utilizando ensayos de neutralización de pseudovirus basados ​​en el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y observamos la neutralización cruzada de SARS-CoV y SARS-CoV-2 con varios candidatos (Fig. 2A, Tabla S4). . En particular, ocho de los candidatos, incluidos 10B8 y 1E4, mostraron una potente neutralización tanto para el SARS-CoV como para el SARS-CoV-2. Se observó neutralización con todos los anticuerpos de unión a RBD y algunos de unión a NTD. Ninguno de los anticuerpos de unión a S2 mostró neutralización en los ensayos de pseudovirus SARS-CoV, SARS-CoV-2 o MERS (Tabla S4). Es importante destacar que se mantuvo una potente capacidad de neutralización para las variantes Alfa, Beta y Delta del SARS-CoV-2. Si bien la potencia se redujo frente a la variante Omicron para algunos candidatos, se mantuvo alta para varios candidatos, en particular 10B8 (Tabla S4).

Pseudovirus y neutralización auténtica de virus. (A) Neutralización de pseudovirus VSV de SARS-CoV y SARS-CoV-2 (valores estimados de IC50) por 16 VHH-Fcs candidatos (bivalentes). (B) Neutralización auténtica del virus SARS-CoV por candidatos seleccionados (formatos monoméricos y bivalentes). (C) Neutralización auténtica del virus SARS-CoV-2 por candidatos seleccionados (formatos monoméricos y bivalentes).

A continuación, se evaluó la potencia de neutralización de candidatos seleccionados en ensayos de virus auténticos SARS-CoV y SARS-CoV-2. La potencia de neutralización general se mantuvo similar a la observada en los ensayos de pseudovirus: dos de los potentes candidatos, 10B8 y 1E4, mostraron valores de CI50 en niveles sub-nM tanto para el SARS-CoV como para el SARS-CoV-2 (Fig. 2B y C). El formato bivalente de 10B8 mostró valores de IC50 de 40 pM y 300 pM para SARS-CoV y SARS-CoV-2, respectivamente. Incluso en el formato monovalente, los valores de IC50 de 10B8 siguieron siendo potentes (150 pM para el SARS-CoV y 2,9 nM para el SARS-CoV-2). Si bien el formato bivalente de 1E4 siguió siendo potente (valores de CI50 de 50 pM y 200 pM para SARS-CoV y SARS-CoV-2 respectivamente), el formato monovalente de esta construcción fue menos potente y los valores de CI50 no se pudieron calcular con las concentraciones utilizadas. en el experimento. De acuerdo con la literatura14, REGN10987 Ab, utilizado como comparador, mostró una potente neutralización para el SARS-CoV-2, pero no para el SARS-CoV.

Utilizamos un ensayo de agrupamiento basado en octetos para evaluar los epítopos de los VHH candidatos. Brevemente, el primer VHH se incubó con la proteína de pico CoV-2, que se capturó en la punta del biosensor, seguido de la unión de un segundo anticuerpo. Se incluyeron anticuerpos de referencia contra RBD (Clase 1: REGN1093314, Clase 3: REGN1098714 y Clase 4: VHH-7215) para clasificar los VHH dirigidos a RBD que descubrimos11. Sorprendentemente, se sabe que catorce de los 15 aglutinantes de RBD agrupados con VHH-7215 se unen a un epítopo críptico de Clase 4 con reacción cruzada en el RBD (Fig. S1A)11. Por el contrario, un aglutinante de RBD (7A9) no se combinó con ninguno de los otros candidatos o anticuerpos de referencia probados, lo que indica un epítopo nuevo. No encontramos ningún VHH dirigido a RBD con reacción cruzada que se uniera a los epítopos de Clase 1 o Clase 2, lo que coincide con la literatura de que los epítopos en la parte superior del RBD son más variables y específicos de la cepa. Del mismo modo, ambos VHH de unión a NTD (19B8 y 16H7) se agruparon (Fig. S1B). Con respecto a los aglutinantes S2, tres de los VHH que no se unieron a MERS se agruparon juntos, mientras que un VHH de triple reacción cruzada (6A1) se agruparon por separado de los cuatro VHH de doble reacción cruzada, lo que indica que de hecho se dirigen a distintos epítopos en el dominio S2 ( Figura S1B). Los otros dos VHH de reacción cruzada triple (S3_29, S3_44) no se evaluaron en este ensayo ya que se unían bien al pico expresado en la superficie celular, pero mal a las proteínas recombinantes (Tablas S1-S3).

A diferencia de los bien documentados anticuerpos de reacción cruzada dirigidos al RBD, los anticuerpos de referencia de unión a S2 con epítopos conocidos son escasos. Por lo tanto, utilizamos espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para mapear los epítopos de las tres clases de aglutinantes S2 que identificamos. Estos incluyeron 6A1 (triple reacción cruzada), 11F5 (doble reacción cruzada) y S3_29, que tuvo triple reacción cruzada en el ensayo de unión FACS (Fig. 3, Fig. S2). Nuestros datos de HDX revelaron tres epítopos de unión distintos para estos VHH dirigidos a S2 con alta confianza. El primer epítopo (que se muestra en azul en la Fig. 3B) está ubicado en la parte superior del dominio S2 y es el objetivo del VHH S3_29 de triple reacción cruzada. Este epítopo es similar al del anticuerpo de reacción cruzada 3A3 del MERS recientemente informado e incluye las mutaciones estabilizadoras S-2P que estabilizan nuestra construcción de picos16. Dada la incapacidad de S3_29 para neutralizar el virus de tipo salvaje y su escasa unión a la proteína recombinante, es probable que estos residuos sean importantes para estabilizar el epítopo conformacional en esta región dinámica de la proteína en lugar de ser directamente importantes para el reconocimiento. El segundo epítopo S2 está ubicado en la región del tallo-hélice en la base de la proteína de pico y es el objetivo de la triple reacción cruzada VHH 6A1. El epítopo final también se encuentra en la base de la proteína de pico, pero por encima de la región de la hélice del tallo (mostrada en naranja y rojo), objetivo del VHH 11F5 de doble reacción cruzada y probablemente de algunos otros VHH que se combinan con él (Fig. .S1B).

Identificación de epítopos de unión a VHH para guiar el diseño de la longitud del enlazador. Los epítopos de aglutinantes S2 seleccionados se determinaron mediante HDX-MS utilizando el dominio S2 de la proteína de pico. (A) Se muestran gráficos de diferencia de intercambio de hidrógeno-deuterio para S3_29, 11F5 y 6A1. Las regiones de secuencia que muestran diferencias significativas son AA962-1006, LVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQT para S3_29; AA899-916, MQMAYRFNGIGVTQNVL y AA1111-1145, EPQIITTDNFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPEL para 11F5; AA1176-1178, VVN y AA1183-1197, DRLNEVAKNLNESL para 6A1. (B) La estructura de la proteína Spike (S) del SARS-CoV-2 se muestra (PDBID: 6XKL) en color gris. La asignación de S3_29 se muestra en azul. El mapeo de 11F5 se muestra en naranja y rojo marcando las secuencias protegidas y desprotegidas por el VHH respectivamente. Como la región a la que se dirige 6A1 no se ha resuelto en una estructura proteica de ectodominio de pico completo, no se muestra en esta figura.

Nos intrigó que el VHH 7A9 de unión a RBD se uniera a un epítopo de reacción cruzada que no se combinaba con ninguno de los anticuerpos de referencia utilizados en este estudio. Para caracterizar el epítopo 7A9, utilizamos nuevamente HDX-MS, lo que indicó que el sitio de unión principal de 7A9 está parcialmente ocluido por el NTD y abarca los residuos 353 a 364 de la proteína de pico (Fig. S3). Para analizar más a fondo este sitio antigénico poco común, utilizamos cristalografía de rayos X para determinar la estructura de 7A9 unido al RBD CoV-2 (Fig. 4, Tabla S5). La estructura revela que la tercera región determinante de la complementariedad (CDR3) de 7A9 forma una plataforma a través de la cual el VHH se une a una hendidura cóncava en el RBD, insertando Leu107 en una pequeña hendidura formada por Tyr396 y Phe464. CDR1 y CDR2 contribuyen sólo mínimamente a la interacción, con Arg31 de CDR1 formando una red de interacciones de Van der Waals y Tyr60 de CDR2 formando un enlace de hidrógeno con Glu465. El impulsor energético de la interacción son probablemente los puentes salinos formados entre Arg357 del RBD y dos glutamatos 7A9 en CDR3, Glu104 y Glu119. En la Fig. 4B se muestra una vista detallada de las interacciones moleculares. La estructura ayuda a racionalizar cómo 7A9 todavía es capaz de unirse y neutralizar la variante Omicron (Tablas S1, S4), ya que el epítopo no se superpone con ninguna de las 15 mutaciones de RBD en este VOC (Fig. 4C). En particular, el epítopo 7A9 está completamente ocluido en el estado cerrado y parcialmente ocluido en el estado abierto de la proteína de pico (Fig. 4D). El modelado de la unión de 7A9 a la proteína de pico CoV-2 completa indica que el VHH introduciría un choque con el NTD del protómero de pico vecino en el estado cerrado o abierto (Fig. S4). Esto sugiere que tendría que ocurrir un cambio conformacional en el RBD en relación con el NTD o una disociación del trímero tras la unión de VHH. De hecho, estudios recientes de HDX y avances en el análisis de la heterogeneidad en datos crio-EM han demostrado que la proteína de pico es bastante dinámica y muestra estados que potencialmente expondrían el epítopo 7A917,18.

VHH 7A9 se une a un epítopo poco común de RBD y desencadena la disociación del trímero de pico. (A) Estructura cristalina de VHH 7A9 unida al RBD del SARS-CoV-2. El RBD se muestra en gris claro con el epítopo resaltado en verde azulado. El VHH se muestra en gris oscuro con CDR1, CDR2 y CDR3 resaltados en verde, azul y rojo, respectivamente. (B) Interacciones moleculares entre VHH 7A9 y el RBD del SARS-CoV-2. El RBD se muestra en gris claro y los residuos de epítopos se muestran en verde azulado. 7A9 se muestra en gris oscuro. Las interacciones polares se indican con líneas discontinuas violetas. (C) SARS-CoV-2 RBD en caricatura y notación de superficie transparente con los carbonos Cα de los residuos mutados en la variante Omicron mostrados como esferas rojas. El epítopo de VHH 7A9 se muestra en verde azulado. (D) Superposición del RBD del SARS-CoV-2 desde la estructura cristalina sobre las estructuras de proteínas de pico cerradas (izquierda) o abiertas (derecha) (PDB: 7DF3 y 6XKL, respectivamente). (E) Análisis de distribución continua (c(s)) de datos analíticos de ultracentrifugación. De arriba a abajo: 7A9 VHH solo, 1E4 VHH solo, SARS-CoV-2 Spike solo, SARS-CoV-2 Spike + 7A9 VHH y SARS-CoV-2 Spike + 1E4 VHH.

Para comprender las consecuencias estructurales de la unión de 7A9 al trímero de pico del SARS-CoV-2, realizamos una serie de experimentos analíticos de velocidad de sedimentación por ultracentrifugación (AUC-SV), utilizando un análisis de distribución continua (c(s)) para determinar las especies presentes. en solución (Fig. 4E, Fig. S5A). La distribución c(s) del pico solo se mostró como un pico único (95% de la señal total) a los 15,9 s, correspondiente a una masa aparente de 441 kDa, consistente con un trímero estable (masa estimada de 398 kDa). 7A9 VHH se mostró como un pico único (93% de la señal total) a los 2,1 s, correspondiente a una masa aparente de 18 kDa, como se esperaba. Luego se mezcló 7A9 con el trímero de púas en una relación molar de 1,5:1 (monómero:monómero). En comparación con el trímero de espiga solo, esta mezcla mostró un cambio dramático en el perfil de sedimentación que es fácilmente evidente en las exploraciones de absorbancia (Fig. S5A). La distribución c(s) reveló 2 especies principales a 2,2 s (7%) y 8,0 s (86%), con masas aparentes de 22 y 155 kDa, respectivamente. Interpretamos estas especies como exceso de 7A9 VHH libre y 7A9 unidos a un monómero de punta (masa teórica de 151 kDa). Sorprendentemente, no quedó ningún trímero de espiga intacto apreciable (15,9 s) después de mezclarlo con 7A9, lo que indica que la unión de 7A9 disoció completamente el trímero de espiga. Para determinar si la disociación del trímero de pico se debió específicamente a la unión de 7A9, realizamos experimentos AUC-SV idénticos utilizando el VHH 1E4, que se predice que se unirá al trímero de pico, pero no lo interrumpirá. De manera similar a 7A9 solo, la distribución c(s) de 1E4 solo mostró un único pico (98% de la señal total) a los 2,1 s, correspondiente a una masa aparente de 19 kDa. La mezcla de 1E4 con el trímero de punta en una proporción de 1,5:1 (monómero:monómero) mostró 2 especies principales a 2,0 s (8%) y 16,7 s (88%), con masas aparentes de 20 y 467 kDa, respectivamente. Interpretamos estas especies como exceso de 1E4 VHH libre y 1E4 unido al temporizador de pico (masa teórica de 451 kDa). Además, analizamos muestras idénticas mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a dispersión de luz de múltiples ángulos (SEC-MALS) y realizamos cálculos de peso molecular mediante un método de análisis conjugado (Fig. S5B). De acuerdo con los experimentos de AUC-SV, observamos la disociación del trímero de pico al unirse a 7A9, pero no a 1E4, siendo las masas calculadas de los complejos comparables a los experimentos de AUC-SV (Fig. S5C). En conjunto, estos datos indican claramente que la unión de 7A9 a su epítopo críptico da como resultado la disociación completa del trímero de espiga del SARS-CoV-2, mientras que el trímero de espiga permanece intacto tras la unión de 1E4.

Se ha informado que la multimerización de VHH puede conducir a una mejora en la potencia8,19,20, y nuestros datos descritos anteriormente en este manuscrito (Fig. 1B) sugirieron que los VHH bivalentes de hecho tienen una mejor afinidad de unión al antígeno en comparación con sus contrapartes monovalentes. Dado tanto el tamaño de la proteína de pico como su naturaleza trimérica, empleamos dos enfoques para lograr una mayor potencia y potencialmente protección contra mutaciones de escape. El primer enfoque fue diseñar homotrímeros de VHH de unión a RBD (1E4, 7A9 y 10B8) para acoplar cada monómero de la proteína de pico simultáneamente y mejorar la potencia. Alternativamente, también diseñamos heterotrímeros dirigidos a tres sitios diferentes en la proteína de pico, que en teoría serían más resistentes a los mutantes de escape, ya que la pérdida de afinidad en cualquier sitio podría compensarse con la unión en los otros sitios. Se diseñaron varias construcciones homo y heterotriméricas utilizando los resultados de la unión de dominios, el mapeo de epítopos y el modelado estructural para determinar las longitudes óptimas de los conectores entre cada VHH.

Para determinar si la multimerización mejora la potencia, comparamos la potencia de neutralización de construcciones multiméricas con mezclas de cócteles de VHH individuales utilizados en el multímero respectivo (Fig. 5, Tabla S6). Un homotrímero de 1E4 mostró una mejora de aproximadamente 26 veces en la neutralización del pseudovirus del SARS-CoV-2 y una mejora de aproximadamente 46 veces en la neutralización del virus auténtico del SARS-CoV-2 (Fig. 5A-C). Asimismo, una construcción heterotrimérica dirigida a RBD, NTD y S2 mostró una mejora de 43 veces en la neutralización con respecto a un cóctel de los mismos tres VHH en el ensayo de pseudovirus del SARS-CoV-2 (Fig. 5D, E). Es importante destacar que esta mejora de la potencia también se observó en la neutralización auténtica del SARS-CoV-2 (Fig. 5F). Además, observamos que la multimerización conduce a una potencia mejorada con varios diseños en los que se podrían combinar VHH débilmente neutralizantes o no neutralizantes para mejorar la potencia (Tabla S6).

La multimerización de VHH da como resultado una potencia de neutralización mejorada. (A) Diseño de multímero VHH homotrimérico con conector de 20 aa (4 × GGGGS) entre VHH monomérico 1E4. La estructura de la proteína Spike (S) del SARS-CoV-2 (PDBID: 6XKL) está coloreada por dominio como en la Fig. 1. (B) Neutralización del pseudovirus VSV del SARS-CoV-2 mediante el monómero 1E4 VHH frente al trímero 1E4 VHH. (C) Neutralización del virus auténtico del SARS-CoV-2 mediante el monómero 1E4 VHH frente al trímero 1E4 VHH. (D) Diseño de multímero VHH heterotrimérico con un conector de 20 aa (4 × GGGGS) entre VHH 7A9 y VHH 19B8 y un conector de 50 aa (GAS) entre VHH 19B8 y VHH S3_29. La estructura de la proteína Spike (S) del SARS-CoV-2 (PDBID: 6XKL) está coloreada por dominio como en la Fig. 1. Diseño heterotrimérico con un conector de 20 aa (4 × GGGGS) entre VHH 7A9 y VHH 19B8 y 50 aa enlazador (GAS) entre VHH 19B8 y VHH S3_29. (E) Neutralización del pseudovirus VSV del SARS-CoV-2 mediante el multímero 7A9-19B8-S3_29 frente a una combinación de 7A9, 19B8 y S3_29 en concentraciones equimolares. (F) Neutralización del virus auténtico del SARS-CoV-2 mediante el multímero 7A9-19B8-S3_29 frente a una combinación de 7A9, 19B8 y S3_29 en concentraciones equimolares.

En este estudio, descubrimos una variedad de VHH con reactividad cruzada contra la proteína de pico del coronavirus y caracterizamos la afinidad de unión, la potencia de neutralización y los epítopos a los que se dirigen estos VHH. Si bien las afinidades de estos VHH en su formato monomérico oscilaron entre <1 nM y > 100 nM, se observaron afinidades <1 nM para el formato bivalente VHH-Fc. Descubrimos que algunos de los VHH tienen una afinidad de unión y una potencia de neutralización excepcionales contra el SARS-CoV-2 que son comparables a los anticuerpos de referencia que se utilizan en la clínica o en el desarrollo clínico (Fig. 2C). Además, estos potentes anticuerpos también pueden neutralizar el coronavirus relacionado SARS-CoV y conservar la actividad contra el Omicron VOC recientemente surgido.

Los VHH de reacción cruzada que identificamos se unen a distintos epítopos en la proteína de pico. La mayoría de los anticuerpos tienen una reacción cruzada con el SARS-CoV y el SARS-CoV-2, pero no con el MERS, lo que se esperaba, ya que el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 están más relacionados y ambos pertenecen a la subfamilia de los Sarbecovirus. La mayoría de los VHH que identificamos apuntan al dominio RBD, y todos los VHH dirigidos a RBD son neutralizantes. Este hallazgo es consistente con la literatura donde se han identificado al menos dos epítopos de neutralización cruzada distintos en el RBD (Clases 3 y 4)11. Curiosamente, la mayoría de los anticuerpos RBD VHH que encontramos se dirigen al epítopo críptico de Clase 4 (dirigido por VHH-7215 y CR302213), lo que sugiere que el tamaño más pequeño de VHH podría facilitar la interacción con este sitio antigénico menos accesible.

Entre los RBD con reactividad cruzada dirigidos a VHH que descubrimos, 7A9 es único, ya que es el único VHH identificado en este estudio que tiene reactividad cruzada y no se combina claramente con ningún otro de los epítopos de Clase 1 a 4. Nuestros enfoques estructurales combinados demuestran claramente que 7A9 se une a un epítopo críptico y altamente conservado en el RBD que está parcialmente ocluido por el pico NTD de CoV-2, lo que proporciona una base estructural para la unión retenida y la neutralización de 7A9 a la variante Omicron. Es importante destacar que nuestros datos también demuestran que la unión de 7A9 conduce a la disociación del trímero de pico de CoV-2. Recientemente, se han informado dos estructuras de anticuerpos que se unen a un epítopo críptico de RBD similar: el VHH biespecífico bn03 (segmento n3130v) y la IgG 553–4921,22. De manera similar a 7A9, ambos anticuerpos se unen a sitios que están parcialmente ocluidos por el NTD de un protómero vecino en el trímero de pico de CoV-2 e inducen la disociación del trímero tras la unión. Sin embargo, la comparación de las estructuras de 7A9, bn03 y 553–49 muestra modos de unión únicos para cada uno (Fig. S6A). La comparación de las huellas de cada anticuerpo muestra que los epítopos de 553–49 y bn03 comparten muy poca superposición entre sí. El sitio de unión de 7A9 se encuentra entre el de 553–49 y bn03 y comparte residuos de epítopos con cada uno de estos anticuerpos (Fig. S6B y C). Los mecanismos divergentes de estos tres anticuerpos se destacan aún más por el hecho de que solo los residuos de RBD R355 y R357 están ubicados cerca de las interfaces de los tres (Fig. S6C y D). Por lo tanto, cada uno de estos anticuerpos puede lograr una amplia especificidad e inducir la disociación de trímeros mediante distintos mecanismos de unión. No está claro por qué estos agentes exhiben diferentes niveles de neutralización viral, lo que podría ser el resultado de múltiples factores, incluido el tamaño, la geometría de unión y la valencia. Curiosamente, en los últimos años se han informado varios anticuerpos que disocian otras proteínas de fusión virales triméricas, incluida la hemaglutinina de la influenza y la proteína de fusión del virus sincitial respiratorio, lo que sugiere que este podría ser un mecanismo común de neutralización de anticuerpos contra los virus respiratorios23,24.

Algunos de los VHH que tuvieron reacción cruzada tanto con el SARS-CoV como con el SARS-CoV-2 apuntan a NTD y S2, y aunque algunos de los aglutinantes de NTD son neutralizantes, ninguno de los aglutinantes de S2 lo neutraliza. También encontramos tres VHH con alta reacción cruzada que también se unían a la proteína de pico del MERS, que pertenece a una subfamilia separada de CoV y CoV-2. Estos tres VHH se dirigen al dominio S2 pero no neutralizaron ninguno de los tres virus. Estos datos sugieren que el dominio S2 está más conservado y presenta múltiples epítopos distintos de reacción cruzada. Si bien estos anticuerpos S2 de unión cruzada no son neutralizantes, es posible que puedan conferir protección in vivo a través de otros mecanismos mediados por Fc. Por lo tanto, realizamos una caracterización adicional para comprender los epítopos específicos a los que se dirigen. A partir de nuestros datos de mapeo HDX, observamos tres epítopos de unión distintos para VHH dirigidos a S2 con alta confianza. El primer epítopo está representado por S3_29, que comparte similitud de secuencia con otro VHH y se dirige a la parte superior del dominio S2. En el estado cerrado de la proteína Spike, esta región no está expuesta ni es accesible a los VHH. Esta región podría quedar expuesta a la unión de VHH de una de dos maneras: (a) cuando varios RBD están en estado abierto, o (b) después de la liberación de S1 pero antes del cambio conformacional que precede a la fusión de membranas. Curiosamente, existe un informe anterior de un anticuerpo que se dirige a la misma región que se mapeó de manera similar utilizando HDX, lo que proporciona evidencia adicional de que este sitio es accesible25. El segundo epítopo está representado por 6A1, que se dirige a la región de la hélice del tallo en la base de la proteína de pico. Si bien no se resuelve en la mayoría de las estructuras de proteínas de pico, estudios previos han informado anticuerpos similares26,27,28,29. Esta región está expuesta independientemente del estado conformacional de la proteína Spike de prefusión. Nuestros datos vinculantes sugieren que este epítopo es el más amplio de este estudio, con reactividad no solo al Sarbecovirus y MERS, sino también a los coronavirus humanos endémicos HKU1 y OC43 que pertenecen a una subfamilia de coronavirus beta diferente de CoV/CoV-2 y MERS. Nuestros datos sugieren que esta región de la proteína de pico es probablemente la más conservada. En el futuro, sería interesante evaluar si la unión de anticuerpos a este epítopo puede ofrecer protección contra la infección y la enfermedad por coronavirus. El epítopo S2 final está representado por 11F5, que se une a la base de la proteína de pico. Curiosamente, este anticuerpo parece causar efectos de protección y desprotección al unirse a la parte inferior de la espiga en nuestro experimento HDX, lo que sugiere que la espiga sufre un cambio conformacional local cuando este anticuerpo se une.

La mayoría de nuestros diseños de multímeros VHH condujeron a una mejora de la potencia, mientras que dos diseños mostraron una pérdida modesta de potencia en comparación con sus respectivos cócteles VHH. Se observó una mejora significativa en la potencia con varios de nuestros diseños de multímeros. Uno de los diseños homotriméricos, 1E4, mostró una mejora significativa de la potencia con respecto a su versión monomérica. Sin embargo, los homotrímeros de 10B8 y 7A9 no mostraron ninguna mejora de potencia con respecto a sus respectivos monómeros. Una posible razón de esto podría deberse a la falta de unión simultánea a los tres protómeros con el diseño actual. Si bien se ha demostrado que las construcciones VHH homotriméricas dirigidas a epítopos RBD mejoran la potencia en comparación con sus contrapartes monoméricas8,19,20, nuestro estudio también mostró una mejora significativa de la potencia con construcciones heterotriméricas en comparación con sus respectivas mezclas de cócteles. En particular, observamos una mejora significativa en la potencia cuando los heterotrímeros se diseñaron utilizando VHH débilmente neutralizantes o no neutralizantes. Por el contrario, cuando los multímeros se diseñaron utilizando neutralizadores fuertes, las mejoras de potencia observadas con respecto a los respectivos cócteles de VHH fueron modestas. Curiosamente, la mayoría de los VHH multiméricos que mostraron el mayor aumento en la potencia de neutralización parecen incluir el VHH S3_29. Especulamos que este epítopo, que se encuentra relativamente más cerca del dominio S1 de la espiga, podría ayudar a estabilizar los componentes dirigidos a RBD o NTD para unirse a sus epítopos. Es posible que la participación simultánea de múltiples epítopos limite la conformación de la proteína de pico, lo que resultará en una mejora de la potencia. Este enfoque también tiene el potencial de proteger contra mutaciones de escape y podría ser valioso para abordar la pérdida de potencia observada en varios candidatos clínicos con la aparición de variantes del SARS-CoV-2. Se podría aplicar una estrategia similar al desarrollo de terapias contra otros patógenos que muestran divergencias significativas.

La proteína de pico estabilizada por prefusión del SARS-CoV (SARS-CoV-PreS) incluye los residuos 1-1190 del ectodominio de la proteína de pico del SARS-CoV (el aminoácido 1 denota la metionina inicial en el péptido señal), dos sustituciones de prolina en K968P y V969P, una Dominio de trimerización de fibritina T4 C-terminal, un sitio de escisión de proteasa HRV3C y una etiqueta His 8 × como se describió anteriormente30. La proteína del ectodominio de pico del SARS-CoV donde no se escindió la etiqueta His (CoV-PreS-3C) contenía un sitio de escisión de trombina en lugar del sitio de la proteasa HRV3C. La proteína de pico estabilizada por prefusión de MERS (MERS-PreS) incluye los residuos 1–1291 del ectodominio de la proteína de pico de MERS, dos sustituciones de prolina en V1060P y L1061P, una sustitución “ASVG” en el sitio de escisión de furina (residuos 748–751, RSVR), un dominio de trimerización de fibritina T4 C-terminal, un sitio de escisión de trombina y una etiqueta His de 8 × similar a la descrita anteriormente31. La proteína de pico estabilizada por prefusión del SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-PreS) incluye los residuos 1 a 1208 del ectodominio de la proteína de pico del SARS-CoV-2, dos sustituciones de prolina en K986P y V987P, una sustitución "GSAS" en la furina sitio de escisión (residuos 682–685, RRAR), un dominio de trimerización de fibritina T4 C-terminal, un sitio de escisión de trombina y una etiqueta His 8 × similar a la descrita anteriormente32. El trímero de proteína de pico del SARS-CoV-2 de conformación “cerrada” (CoV-2-PreS-Closed) contiene los residuos 1–1208 del ectodominio de la proteína de pico del SARS-CoV-2, cuatro sustituciones de aminoácidos (D614N, A892P, A942P y V987P). ), un sitio de escisión de trombina y una etiqueta His de 8 × similar a la descrita anteriormente33. Las construcciones proteicas del dominio de unión al receptor (RBD) y del dominio N-terminal (NTD) se diseñaron de la siguiente manera. Las construcciones de pico CoV-2-S-RBD-SD1 y pico CoV-2-S-NTD contienen los residuos 319–591 y 1–305, respectivamente, clonados en marco con la secuencia señal nativa de CoV-2 y adjuntos con un T4 C-terminal. dominio de trimerización de fibritina, un sitio de escisión de trombina y una etiqueta His de 8 × similar a la descrita anteriormente32. Las construcciones de proteína de pico CoV-S-RBD-SD1 y MERS-S-RBD-SD1 contienen los residuos 306–577 y 367–655, respectivamente, clonados en marco con el péptido señal de la proteína nativa, un sitio de escisión de trombina y un 8 × His- etiqueta. La construcción de la proteína de pico del SARS-CoV-2 (CoV-2-PreS-S2) de dominio S2 únicamente incluye los residuos de ectodominio 697–1208 con dos sustituciones de prolina en K968 y V969 clonados en el marco inmediatamente aguas abajo de un péptido señal de IgK y añadidos con un T4 dominio de trimerización de fibritina, sitio de escisión de trombina y etiqueta His 8 × en el extremo C-terminal. Las construcciones biotiniladas incluyen una secuencia de etiqueta Avi inmediatamente aguas arriba del sitio de escisión de la proteasa flanqueada por conectores GRS-GG. La construcción CoV-2-S-RBD utilizada para cristalografía de rayos X contiene los residuos 319–541 y se clonó en marco con la secuencia señal nativa de CoV-2 y contenía un SG-6xHis C-terminal. Todas las regiones que codifican genes se optimizaron con codones de mamíferos y se subclonaron en un vector de expresión eucariótico bajo el control del promotor CMV.

Los plásmidos se transfectaron transitoriamente en células Expi 293F (ThermoFisher) usando Expifectamine (ThermoFisher) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los sobrenadantes celulares se recogieron 72 h después de la transfección y se clarificaron mediante centrifugación a 10.700 x g a 20 °C durante 30 min. Se añadió PS-20 a una concentración final del 0,01 % a los sobrenadantes clarificados para mitigar la agregación. Los sobrenadantes clarificados se dividieron en alícuotas en botellas Corning de 250 ml y se transfirieron a -70 °C para su almacenamiento hasta la purificación.

El sobrenadante clarificado se descongeló en un baño de agua con agitación a 37 °C y se llevó a cabo la purificación. La proteína Spike se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) en una columna HisTrap Ni Sepharose Hi Performance (Cytiva) en un sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida. La etiqueta de purificación se escindió con trombina (Cytiva) o proteasa HRV3C (Accelagen) y se incubó durante la noche a 25 °C o 4 °C, respectivamente, con agitación suave para eliminar el imidazol. Para las proteínas con un peso molecular similar al de la trombina, la etiqueta His de las proteínas recombinantes se escindió utilizando el kit Thrombin CleanCleave™ (Sigma-Aldrich) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

La proteína Spike se purificó aún más mediante un segundo paso IMAC sustractivo en una columna HisTrap FF (Cytiva) para separar las proteínas Spike escindidas de la proteasa, los contaminantes y la Spike no escindida. Si se requiere biotinilación, la proteína Spike purificada se biotiniló después de IMAC sustractiva utilizando el kit de biotinilación (Avidity LLC) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El paso de purificación final de la muestra se logró con cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) utilizando una columna HiLoad™ 26/600 Superdex™ de 200 pg (Cytiva) para SARS-CoV-2-PreS y MERS-PreS y una HiPrep™ 26/60 Sephacryl. Columna S-300 HR (Cytiva) para SARS-CoV-PreS con HEPES 50 mM, pH 7,5, tampón de ejecución de NaCl 300 mM (NaCl 150 mM para SARS-CoV-2-PreS-Closed). Las fracciones que contenían proteína de interés se agruparon basándose en cromatogramas SEC, se concentraron, si era necesario, y se filtraron antes de dividirlas en alícuotas y congelarlas instantáneamente en nitrógeno líquido. La concentración final de proteína se cuantificó mediante el análisis del espectrofotómetro NanoDrop™ 2000c (Thermo Scientific) A280 después de que la pequeña cantidad de muestra se desnaturalizara utilizando clorhidrato de guanidina 6 M. La pureza de la proteína se estimó mediante la intensidad de las bandas en un gel teñido con Coomassie. El estado y el tamaño de la oligomerización de proteínas se confirmaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz láser multiángulo (SEC-MALLS).

El diseño de la construcción, la expresión y la purificación del trímero F postfusión de MPV humano se han descrito previamente34.

La construcción utilizada para la cristalografía de rayos X, SARS-CoV-2-S-RBD (519–541), se recogió 72 h después de la transfección, el sobrenadante se aclaró mediante centrifugación y se intercambió concentrado/tampón mediante filtración de flujo tangencial en HEPES 25 mM. pH 7,5, NaCl 300 mM. La muestra se purificó mediante IMAC sobre una columna HisTRAP FF (Cytiva) y una posterior columna Superdex 75 en HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. La muestra se concentró a 10 mg/ml y se congeló instantáneamente. El 7A9 VHH se recogió 6 días después de la transfección y se aclaró. El sobrenadante se purificó mediante IMAC en una columna HisTRAP Excel (Cytiva) en HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM y posterior Superdex 75 en HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. La muestra se concentró a 10 mg/ml y se congeló instantáneamente. Para el complejo RBD/7A9 VHH, las muestras se descongelaron y se mezclaron usando un exceso de VHH 1:1,5 (RBD:VHH) y se incubaron a 4 °C durante una hora. Luego se purificó el complejo sobre una columna Superdex 75 en HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. El complejo purificado final se concentró a 10,7 mg/ml y se congeló instantáneamente.

Las proteínas de pico recombinantes del SARS-CoV-2 de diferentes variantes utilizadas en ELISA se obtuvieron de Acro Biosystems: variante B.1.1.7 (Cat# SPN-C52H6), variante B.1.351 (Cat# SPN-C52Hk), variante P.1. (Cat# SPN-C52Hg), variante B.1.617.2 (Cat# SPN-C52He), BA.2 (Cat# SPN-C5223), BA1.1 (Cat# SPN-C52Hz).

Las cadenas de anticuerpos pesado (HC) y ligero (LC) del monómero VHH, VHH-Fc y IgG1 humana se clonaron por separado en nuestro vector interno basado en pTT5 que lleva etiquetas de secreción líder Lonza y promotor CMV. Los plásmidos de monómero VHH-Fc y VHH se transfectaron transitoriamente en el sistema de expresión ExpiCHO utilizando medios definidos sin suero y células CHO adaptadas a suspensión siguiendo las recomendaciones del fabricante con el protocolo Max-Titer. Los plásmidos para los anticuerpos HC y LC convencionales IgG1 se transfectaron transitoriamente en una proporción de 1:1 en el sistema de expresión ExpiCHO utilizando medios definidos sin suero siguiendo las recomendaciones del fabricante con el protocolo Max-Titer. Las células se recolectaron después de 7 días con alimentación los días 1 y 5 y un cambio de temperatura a 32 ° C el día 1. Se utilizó cromatografía de afinidad de proteína A de alto rendimiento (HT) (Mabselect) en columnas en miniatura (Robocolumns) para la captura y el enriquecimiento de anticuerpos recombinantes a partir de líquido de cultivo celular de recolección clarificado (HCCF). Para el control de calidad de las moléculas expresadas se utilizó exclusión analítica por tamaño (aSEC) para caracterizar el comportamiento de la solución y electroforesis capilar (CE-SDS) para caracterizar en condiciones desnaturalizantes. Se eligió un criterio aceptable de pureza general para las moléculas seleccionadas y los anticuerpos normalmente tenían > 90 % de pureza según lo determinado por aSEC.

Las cadenas de anticuerpos multímeros de VHH se generaron fusionando 3 VHH con diferentes longitudes de conector y clonando en nuestro vector interno basado en pTT5. Los enlazadores utilizados fueron 20 aa (4 × GGGGS), 50 aa (5 × GSAGSAAGSG) 35 o 90 aa (4,5 × ASPAAPAPASPAAPAPSAPA) 36. Los plásmidos multímeros VHH se transfectaron transitoriamente en el sistema de expresión Expi293 en suspensión utilizando medios definidos sin suero siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron después de 5 días con alimentación el día 1. La cromatografía de afinidad de Ni (Ni Sepharose Excel – Cytiva) usando columnas de flujo por gravedad permitió la purificación en 1 paso de anticuerpos recombinantes a partir del líquido de cultivo celular clarificado. Se utilizó aSEC para caracterizar los multímeros.

Todos los procedimientos con animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Capralogics, Inc., un centro de investigación regulado por el USDA. Todo el trabajo con animales realizado cumplió con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por el Consejo Nacional de Investigación37, las Directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria para la Eutanasia de Animales38 y las directrices ARRIVE39.

Se inmunizaron cuatro llamas en Capralogics utilizando una estrategia de refuerzo de inmunización con proteínas recombinantes heterólogas. Este enfoque implicó una inyección subcutánea inicial de las cuatro llamas con 0,5 mg de proteína de pico del SARS-CoV-2 mezclada con adyuvante completo de Freund. Para las dos inyecciones restantes, dos llamas recibieron adyuvante de Freund (IFA) incompleto y dos llamas no recibieron adyuvante adicional. Las inyecciones se realizaron con tres semanas de diferencia e incluyeron una segunda inyección subcutánea de 0,5 mg de proteína MERS y luego una tercera inyección subcutánea de 0,5 mg de proteína de pico del SARS-CoV. Diez días después de la inyección final, se recogieron 200 ml de sangre total de las llamas en tubos de extracción de sangre con heparina. Luego se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad. También se evaluaron los títulos séricos contra la proteína de pico SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS mediante ELISA y se seleccionaron dos llamas para su posterior procesamiento (una que usó una estrategia de inyección IFA y otra que no usó ningún adyuvante para las inyecciones excepto el primario). inyección.)

Las PBMC de llama purificadas de los animales inmunizados se tiñeron en la superficie celular usando SARS CoV-2 biotinilado o proteína de pico MERS biotinilada, conjugado FITC IgG anti-llama de cabra (H + L) (Thermo Cat# A16061), tinción de células vivas/muertas 7-AAD (Biolegend, Cat# 420404) y estreptavidina BV421 (Biolegend Cat# 405226). Las células B vivas, positivas para antígeno biotinilado e IgG, se clasificaron como células individuales en placas de 96 pocillos o se clasificaron en masa en tubos utilizando un BD FACSAria Fusion.

Las células clasificadas individualmente se cultivaron durante dos semanas con una línea celular recombinante CD40L-EL4 irradiada con rayos gamma y citocinas de llama IL-2/IL-21 elaboradas internamente a 37 °C. Después de dos semanas, se examinaron los sobrenadantes del cultivo de células B utilizando ELISA y FACS para determinar su unión a proteínas recombinantes o expresadas en células. Luego se lisaron los candidatos de interés en 85 uL de tampón Qiagen TCL con B-mercaptoetanol al 1 % y se aisló el ARN utilizando tubos Qiagen Turbocapture (Qiagen Cat# 72251).

El ADNc se generó utilizando la transcriptasa inversa SuperScript IV (Thermo, Cat #18090050) en presencia de un oligo de cambio de plantilla (TSO) para 5'RACE. Luego se realizó una reacción de PCR de primera ronda usando la polimerasa GoTaq (Promega, Cat # M7422), un cebador inverso de región constante específico del gen de cadena pesada de llama únicamente y un cebador directo compatible con TSO. Una segunda ronda de PCR, que también utilizó la polimerasa GoTaq, amplificó aún más los productos de PCR e introdujo adaptadores e índices Illumina MiSeq NGS para secuenciación NGS multiplexada de alto rendimiento. Luego se combinaron productos de PCR indexados individuales y se purificaron en gel usando un kit de purificación en gel de Qiagen (Qiagen Cat# 28704). Las secuencias que mostraron reactividad cruzada entre 2 o más cepas mediante ELISA o FACS se identificaron y expresaron de forma recombinante para realizar pruebas adicionales.

Las células B clasificadas en masa se lisaron inmediatamente en tampón RLT de Qiagen con B-mercaptoetanol al 1% y se aisló el ARN utilizando el microkit Qiagen RNeasy (n.º de catálogo 74004). El ADNc se generó utilizando la transcriptasa inversa Superscript IV (Thermo, n.º de catálogo 18090050). ) en presencia de un oligo de cambio de plantilla (TSO) que contiene un identificador molecular único (UMI) para permitir 5'RACE y la corrección de errores durante el análisis de los datos de secuenciación NGS. Luego se realizaron dos rondas de PCR usando KAPA HiFi Polymerase (KAPA, Cat # KK2501), un cebador inverso de región constante específico del gen de cadena pesada de llama únicamente y un cebador directo compatible con TSO. Los cebadores también incluyeron índices para identificar muestras específicas y adaptadores Illumina MiSeq. Luego se combinaron productos de PCR indexados individuales y se purificaron en gel utilizando un kit de purificación en gel de Qiagen (Qiagen Cat# 28704). Se utilizó análisis bioinformático para comparar datos de secuenciación de células B clasificadas utilizando la proteína de pico SARS CoV-2 y la proteína de pico MERS para observar para secuencias comunes entre las dos bibliotecas, lo que indica una posible reactividad cruzada de una secuencia para al menos dos cepas. Dos candidatos identificados utilizando este enfoque se expresaron de forma recombinante.

Se recubrieron placas de media área de 96 pocillos con 25 uL/pocillo de proteínas de pico de longitud completa o proteínas de dominio (1 µg/mL en tampón PBS) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces con PBST (PBS + Tween 20 al 0,05%) y se bloquearon con 25 uL/pocillo de tampón de bloqueo (PBS con FBS al 5%) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se transfirió el sobrenadante del cultivo de células B o el anticuerpo purificado titulado a 25 ul/pocillo a las placas de 96 pocillos y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego las placas se lavaron 3 veces con PBST. Luego se agregaron a las placas 25 ul/pocillo de IgG anti-llama de conejo (H + L) HRP (dilución 1:1000 en tampón de bloqueo, Thermo Scientific Cat# A16154) o un anticuerpo secundario específico para el Fc del anticuerpo purificado y se incubaron. durante 60 min a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron 5 veces con PBST y se revelaron agregando reactivo TMB (Thermo Cat# 34,029) a las placas durante 2 a 3 minutos. Las reacciones se detuvieron con ácido sulfúrico 0,16 M y se leyó la absorbancia a 450 nm y 650 nm usando un espectrofómetro. Los valores de CE50 para la unión a proteínas se calcularon utilizando la herramienta de ajuste de curvas de regresión no lineal en GraphPad Prism para log(agonista) frente a respuesta (tres parámetros), utilizando datos de densidad óptica (DO) recopilados en cada concentración por duplicado.

Se generaron líneas celulares recombinantes CHO K1 que expresan de manera estable proteínas de pico de diferentes cepas de virus (SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS, HKU1 y OC43) utilizando aa 1–1236 del SARS-CoV, aa 1–1254 del SARS-CoV. -2, aa 1–1337 de MERS, aa 1–1334 de HKU1 y aa 1–1336 de OC4340. Las células se cultivaron en una incubadora con agitación a 37 ° C, 6 % de CO2, 75 % de humedad y 120 RPM. Las células se cultivaron en medio CD CHO (Gibco, Cat# 12490) con L-glutamina 4 mM (Avantor, Cat# 2078), mezcla de hipoxantina/timidina al 1% (Gibco Cat# 11067), Blasticidina 4 mg/L (Gibco, Cat# A11139) y 200 mg/L de zeocina (Invitrogen, Cat# R25005), se recogieron usando tripsina y se lavaron dos veces con tampón PBS. Se diluyó colorante de traza celular (CellTrace-violet Thermo Scientific Cat# C34557 y CellTrace-Far Red Thermo Scientific Cat# 34564) en concentraciones optimizadas en PBS (1 ml de volumen de tinción/10 M de células) y se usó para resuspender sedimentos celulares preparados a partir de los diferentes líneas celulares recombinantes. Las células se incubaron con los colorantes a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad, con agitación ocasional. Estas reacciones de tinción se detuvieron agregando medio completo DMEM/F12 tibio con 10% de FBS, usando 5 veces el volumen de tinción original, y se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. Las células teñidas se centrifugaron y se lavaron una vez con 10 ml de PBS y se resuspendieron en tampón FACS (5% de suero bovino fetal en PBS). Luego se verificaron las células para confirmar la tinción positiva con los tintes y que cada línea celular recombinante demostrara una intensidad fluorescente separada usando un Intellicyt (Sartorius). Luego se mezclaron las diferentes líneas celulares recombinantes resuspendiéndolas en tampón FACS y se dividieron en alícuotas en placas de 96 pocillos (50 ul/pocillo, 80 x 10^4/pocillo). Las células se tiñeron con 50 ul de anticuerpos purificados y titulados o con sobrenadante de cultivo de células B durante 30 minutos y luego se centrifugaron y se lavaron 1X con tampón FACS. Finalmente, las células se tiñeron con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (específico para el dominio Fc del sobrenadante o anticuerpo recombinante) durante 30 minutos y se centrifugaron y lavaron 2 veces con tampón FACS. Luego se analizaron las células resuspendidas en 50 ul de tampón FACS usando un Intellicyt. Los valores de EC50 para la unión a FACS se calcularon utilizando la herramienta de ajuste de curvas de regresión no lineal en GraphPad Prism para log(agonista) frente a respuesta (tres parámetros), utilizando datos de intensidad de fluorescencia media (MFI) recopilados en cada concentración por duplicado.

Las afinidades de VHH y las afinidades aparentes bivalentes de VHH-Fc se midieron en un Biacore 4000 (Cytiva). La proteína ECD Spike PreS del SARS-CoV-2 se biotiniló mediante una etiqueta Avi C-terminal y se inmovilizó de 600 RU a 1500 RU en un chip sensor SA Serie S recubierto con estreptavidina (Cytiva, n.º de catálogo 29699621). Se inyectaron VHH de 3,7 nM a 300 nM y VHH-Fc se inyectaron de 2,5 nM a 200 nM. Las inyecciones duraron 3 minutos y la disociación se controló durante 10 minutos. El tampón de ejecución fue HBS EP+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05 %, pH 7,4) y 25 °C. La superficie se regeneró con una inyección de 30 s de glicina pH 1,9. Los datos se ajustaron a un modelo de unión 1:1 utilizando el software Biacore Evaluación versión 1.1.

Se realizaron experimentos de agrupación en tándem en Octet-HTX (Sartorius) utilizando tecnología BLI para agrupar anticuerpos proteicos anti-CoV-2. La proteína PreS-AVI biotinilada CoV-2 Spike ECD (20 nM) se capturó en biosensores recubiertos con estreptavidina (SA) (Sartorius) durante 20 minutos para obtener una respuesta de unión de 1,5 a 2 nm. El primer anticuerpo (20-40 ug/ml) se pasó a la proteína de pico trímero del SARS-CoV-2 hasta que todos los sitios de unión se saturaron, seguido de la unión de 20 a 40 ug/ml del segundo anticuerpo. Se utilizaron aglutinantes de referencia de Clase 1, Clase 3 y Clase 4 para clasificar el aglutinante de dominio RBD. Se utilizaron cuatro anticuerpos generados internamente para detectar los aglutinantes de los dominios NTD y S2. Se utilizó tampón cinético (1XKB, PBS + Tween20 al 0,02%, BSA al 0,1%, azida sódica al 0,05%) como tampón de ejecución. Los biosensores se regeneraron (glicina 1,7 nM) seguido de un lavado con tampón dos veces después de cada ciclo. Se utilizaron placas de fondo inclinado de polipropileno negro de 384 pocillos para el experimento de agrupación.

Las partículas de pseudovirus que contienen construcciones rVSVΔG-Luc se elaboraron como se describió anteriormente40,41,42. En el estudio actual se utilizaron las proteínas de pico de coronavirus CoV-2-SΔ18 WT o variantes, SARS-SΔ19 o MERS-SΔ16.

El ensayo de neutralización de pseudovirus y el cálculo de IC50 se realizaron como se describió anteriormente en la Ref.40 con una ligera adaptación: se usaron células Vero E6 (ATCC) a 22 000 células/pocillo para MERS, además de 293 células T ACE2 utilizadas como se describe para SARS-CoV-2. WT y variantes y SARS-CoV.

Todo el trabajo con virus auténticos SARS-CoV y SARS-CoV-2 se completó en laboratorios BSL-3 del Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de los Estados Unidos (USAMRIID) de acuerdo con las normas y regulaciones de bioseguridad federales e institucionales como se describió anteriormente40.

En USAMRIID se completaron ensayos de neutralización auténticos de SARS-CoV/Urbani y SARS-CoV-2 como se describió anteriormente40.

Para mapear el epítopo de unión para S3_29, 11F5 y 6A1, se llevaron a cabo experimentos HDX-MS utilizando un dominio S2 de proteína de pico (SARS-COV-2-PreS-S2-His) descrito anteriormente. La solución de proteína era 1,9 mg/ml (PM ~ 60 kDa, equivalente a ~ 30 µM) en HEPES 50 mM, NaCl 300 mM y tampón de pH 7,5. Para formar el complejo S2:VHH, se incubó un volumen igual de S2 30 µM con VHH 30 µM a 4 °C durante 30 minutos como solución madre. Los experimentos HDX-MS se realizaron utilizando un sistema HDX automatizado (Waters Corporation, MA, EE. UU.) como se describió anteriormente43. Brevemente, se diluyeron diez veces seis microlitros de solución madre de S2 o S2:VHH con tampón de marcado a 20 °C para iniciar la reacción de intercambio de deuterio. Los puntos de tiempo de etiquetado fueron 0, 10 s, 1, 10 y 100 min. Se mezclaron cincuenta microlitros de solución de proteína diluida con un volumen igual de tampón de extinción (urea 8 M, TCEP 1 M en tampón fosfato 100 mM, pH 2,5) a 4 °C, del cual se inyectaron 90 µl al sistema LC/MS. . La digestión en línea se realizó utilizando una columna de proteasa tipo XIII/pepsina inmovilizada (p/p, 1:1), 2,1 × 30 mm (NBA2014002, NovaBioAssays, LLC, MA, EE. UU.).

Para mapear el epítopo de unión para 7A9, se realizaron experimentos HDX-MS utilizando el dominio RBD del SARS-CoV-2 descrito anteriormente. La solución de proteína era 2,6 mg/ml (PM ~ 31 kDa, equivalente a ~ 83,5 µM) en fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 75 mM, sacarosa al 3 % y tampón de pH 7,4. El complejo CoV-2 RBD y 7A9 VHH se preparó mezclando 15 µl de 2,6 mg/ml de CoV-2 RBD recombinante con 11,7 µl de 3,89 mg/ml de 7A9 VHH y 43,3 µl de PBS. El RBD de CoV-2 recombinante solo se preparó mezclando 15 µl de RBD de CoV-2 recombinante de 2,6 mg/ml con 55 µl de PBS. Se incubaron 10 µl del RBD CoV-2 recombinante solo o del complejo RBD:VHH con 90 µl de tampón de control (fosfato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM a pH 7,4) o tampón de etiquetado de óxido de deuterio (fosfato de sodio 50 mM, sodio 100 mM). cloruro a pD 7,0). El tiempo de etiquetado fue de 0 s, 15 s, 60 s, 600 s o 3600 s a 8 °C. El intercambio de hidrógeno/deuterio se detuvo añadiendo 100 µl de guanidina HCl 4 M, tampón TCEP 0,85 M (el pH final fue 2,5). Luego la mezcla se sometió a digestión en columna usando la columna de proteasa tipo XIII/pepsina. Los péptidos resultantes se atraparon y desalinizaron en una precolumna ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard (130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 5 mm, 186.003.975, Waters) durante 3,5 min a 160 µl/min. Luego, los péptidos se eluyeron de la trampa usando un gradiente de acetonitrilo del 2 al 30 % (con ácido fórmico al 0,3 %) durante 12,5 min a un caudal de 150 µl/min y se separaron en una columna C8 de 50 x 1 mm (3 µm, NBA2014015, NovaBioAssays LLC, MA, EE. UU.). Se utilizó un sistema UPLC-MS compuesto por un UPLC Waters Acquity acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap cuadrupolo híbrido Q Exactive™ HF (Thermo) como se describió anteriormente44. El disolvente A era ácido fórmico al 0,3% en agua. La válvula de inyección y la columna de enzimas y sus tubos de conexión relacionados estaban dentro de una caja de enfriamiento mantenida a 8 °C. La segunda válvula de conmutación, la columna C8 y sus tubos de conexión de acero inoxidable relacionados estaban dentro de otra caja de circulación enfriada mantenida a -6 °C. La identificación de péptidos se realizó mediante la búsqueda de datos de MS/MS frente a la secuencia RBD de CoV-2 utilizando Byonics (Protein Metrics, CA, EE. UU.). La tolerancia de masa para los iones precursores y productos fue de 10 ppm y 0,02 Da, respectivamente. Los espectros de masas de las muestras deuteradas se registraron únicamente en modo MS. Los datos de MS sin procesar se procesaron utilizando HDX WorkBench, software para el análisis de datos de MS de intercambio H/D45. Los niveles de deuterio se calcularon utilizando la diferencia de masa promedio entre el péptido deuterado y su forma no deuterada (t0).

El complejo RBD-7A9 a 9,5 mg/ml se trató durante la noche con EndoH a 4 °C y se usó en ensayos de cristalización sin purificación adicional. Los cristales del grupo espacial P3221 se cultivaron a 20 ºC mediante difusión de vapor en gotas sentadas utilizando una proporción de gotas de proteína: solución de depósito de 2:1. La solución de depósito contenía malonato de sodio 0,2 M, pH 6,0 y PEG 3350 al 18 %. Los cristales se crioprotegieron en una solución de depósito suplementada con glicerol al 25 %.

Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la línea de luz 17-ID en Advanced Photon Source. Los datos se procesaron utilizando autoPROC46 y se truncaron elípticamente utilizando STARANISO47. La estructura se resolvió mediante reemplazo molecular en Phenix48 utilizando el RBD del SARS-CoV-2 (PDB 7E7Y; Ref.49) y un modelo de homología de 7A9 con las CDR eliminadas como modelos de búsqueda. En la unidad asimétrica había una copia del complejo. Luego, la estructura fue reconstruida en Coot50 y sometida a rondas iterativas de refinamiento y reconstrucción utilizando Phenix y Coot. Las estadísticas de procesamiento y refinamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 5.

Para los experimentos de AUC, utilizamos el ectodominio de la proteína SARS-CoV-2-PreS-Closed Spike, como se describe anteriormente. Esta construcción contiene cuatro sustituciones de aminoácidos estabilizadores (D614N, A892P, A942P y V987P) y forma un trímero estable sin una secuencia de trimerización artificial. Las muestras contenían 6 μM de 7A9 o 1E4 VHH y/o 1,33 μM de trímero de punta cerrada CoV-2-PreS (monómero 4 μM) en tampón AUC (HEPES 50 mM, pH 7,5 + NaCl 150 mM). Las muestras se mezclaron y luego se incubaron en una plataforma giratoria a temperatura ambiente durante 3 h. Se cargaron 0,4 ml de cada muestra en el lado derecho y 0,4 ml de tampón AUC en el lado izquierdo de una celda AUC que contenía ventanas de zafiro y una pieza central de EPON de carbón de doble sector. Las células equilibradas se cargaron en un rotor An50Ti y se equilibraron térmicamente en la cámara de un Beckman Optima AUC al vacío a 25 °C durante 1 h. Las muestras se centrifugaron a 40.000 RPM y se tomaron un total de 300 exploraciones a intervalos de 40 s utilizando ópticas de absorción ajustadas a 280 nm. Los valores de densidad del tampón, viscosidad y volúmenes específicos parciales de las proteínas se calcularon en el software Sednterp51. Cada quinto escaneo (60 en total) se cargó en el programa Sedfit para el análisis de distribución continua (c(s))52. El ajuste inicial de los parámetros se realizó de forma iterativa para minimizar los valores rmsd. Después de probar múltiples valores, el coeficiente de fricción se mantuvo constante en 1,2 para todas las muestras. Después de optimizar los parámetros de ajuste utilizando 60 escaneos, se analizaron los 300 escaneos y los picos se integraron en Sedfit. Todas las cifras de AUC se generaron utilizando el software Matplotlib53.

Los experimentos SEC-MALS se realizaron en un sistema HPLC Agilent 1260 Infinity II utilizando una columna Superose 6 Increment 10/300 GL (Cytiva) a temperatura ambiente. El sistema estaba equipado con un detector UV HPLC de Agilent (280 nm) y detectores de dispersión de luz DAWN Heleos II y de índice de refracción T-rEX de Wyatt Technology. La fase móvil estaba compuesta de tampón PBS suplementado con azida sódica al 0,02% y fluyó a una velocidad de 0,5 ml/min. Los coeficientes de extinción de proteínas se calcularon en función de la secuencia utilizando Expasy ProtParam asumiendo una unión 1 a 1 para los complejos Spike-VHH. Los valores del índice de refracción (dn/dc) se estimaron en 0,185 y 0,134 ml/g para los restos de proteína y glucano, respectivamente. Las muestras se mezclaron e incubaron como se describe en la sección de métodos AUC y posteriormente se filtraron a través de una membrana de 0,22 μm (Millipore). Para cada ejecución, se inyectaron en la columna 0,1 ml de muestra (entre 11 y 64 μg de proteína total). Los valores de peso molecular se determinaron en el software ASTRA (Wyatt Technology) utilizando un análisis conjugado. Los datos se exportaron y las cifras se realizaron utilizando el software GraphPad Prism.

Después de la combinación de dominios y el mapeo de epítopos HDX, se determinaron el epítopo aproximado y la ubicación de unión de muchos VHH monoméricos contra la proteína de pico. Para calcular la longitud del conector deseado entre dos VHH, se midió la distancia entre el centro del epítopo conocido tanto en el estado abierto como cerrado de la proteína de pico en MOE 2020.09 (Chemical Computing Group). Para tener en cuenta los casos en los que la distancia más corta entre dos sitios daría como resultado un choque y para tener en cuenta la orientación de unión desconocida del VHH en relación con la proteína de pico (donde se ubicaría el extremo), se agregó una distancia de amortiguación adicional a la medición inicial. Dado que un aminoácido puede cubrir entre 3,5 y 4,0 angstroms en una conformación extendida, la distancia medida se convirtió luego en una cantidad mínima de aminoácidos que serían necesarios para salvar dicha distancia. El número resultante de aminoácidos se convirtió luego en el número mínimo de subunidades enlazadoras que podrían conectar los dos sitios.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura para la estructura cristalina informada se han depositado en el Protein Data Bank con el código de acceso 8SK5.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Scott Cosmi, ex miembro del Servicio Científico Profesional de Eurofins Lancaster Laboratories, Lancaster, PA, por su trabajo en la purificación de las proteínas antigénicas, a Eberhard Durr (Infectious Disease and Vaccine Discovery, Merck & Co) por la caracterización de proteínas recombinantes, y Courtney Cohen (Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de los Estados Unidos/USAMRIID) por su ayuda con los ensayos de neutralización viral auténticos. Los autores también desean agradecer a Capralogics, Inc. por su trabajo en el cuidado e inmunización de las llamas utilizadas para la generación de VHH. Además, los autores desean agradecer a Kalpit Vora, Jill Chrencik, Mas Handa e Ilker Donmez por la revisión interna del manuscrito. Los autores dedican este artículo a la memoria de David Tellers, quien no sólo actuó como mentor de varios autores, sino que también brindó reflexivas discusiones y orientación clave al comenzar este trabajo.

Scott Hollingsworth

Dirección actual: Estructura y diseño molecular, Investigación y desarrollo de Bristol-Myers Squibb, 700 Bay Road, Redwood City, CA, 94063, EE. UU.

Laura J.Kingsley

Dirección actual: Boehringer Ingelheim, 900 Ridgebury Rd, Ridgefield, CT, 06877, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Scott A. Hollingsworth y Cameron L. Noland.

Química Computacional y Estructural, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Scott A. Hollingsworth, Cameron L. Noland, Haihong Zhou, Michael Eddins, Todd Mayhood, Jacob Gomez-Llorente, Andrea Patridge y Alan C. Cheng

Discovery Biologics, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Karin Vroom, Anasuya Saha, Miranda Sam, Qinshan Gao, David U. Grandy, Sujata Singh, Xiaohong Shirley Ma, Daniel Malashock, Karthik Sathiyamoorthy, Fahimeh Raoufi, Yinyan Tang, Shi-Juan Chen, Marc Bailly, Laura J. Kingsley, Bernhard H. Geierstanger, Daniel M. Gorman y Kalyan Pande

Enfermedades infecciosas y descubrimiento de vacunas, Merck & Co., Inc., 770 Sumneytown Pike, West Point, PA, 19486, EE. UU.

Zhiyun Wen, Christopher Warren, Jennifer Galli, Gwenny Go y Lan Zhang

Ciencia de datos e informática, Merck & Co., Inc., 126 E. Lincoln Ave., Rahway, Nueva Jersey, 07065, EE. UU.

Arturo Friedman

NovaBioAssays, LLC, 52 Dragon Ct, Woburn, MA, 01801, EE. UU.

Cheng Jie Ji

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SAH, BHG, DMG, LZ y KP diseñaron la investigación. CLN, KV, AS, MS, QG, HZ, DUG, SS, ZW, CW, XSM, DM, JG, GG, ME, TM, KS, FR, YG-L., AP, YT, S.-JC, MB y CJ generaron reactivos y realizaron los experimentos. SAH, CLN, KV, CW, AF, LJK, AC, LZ y KP realizaron análisis. Todos los autores contribuyeron a la redacción y revisión del artículo.

Correspondencia a Lan Zhang o Kalyan Pande.

Todos los autores, excepto Chengjie Ji, son empleados actuales o anteriores de Merck Sharp & Dohme Corp., una subsidiaria de Merck & Co., Inc., Rahway, Nueva Jersey, EE. UU. Chengjie Ji es empleada de NovaBioAssays, LLC, Woburn, MA, EE. UU. Un subconjunto de los autores (SAH, KV, AS, DUG, BHG, DMG, LZ y KP) figuran como inventores en una patente que rodea este trabajo en poder de Merck Sharp & Dohme Corp.

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Reimpresiones y permisos

Hollingsworth, SA, Noland, CL, Vroom, K. et al. Descubrimiento y multimerización de anticuerpos de dominio único con reacción cruzada contra virus similares al SARS para mejorar la potencia y abordar las variantes emergentes del SARS-CoV-2. Representante científico 13, 13668 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40919-7

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Recibido: 19 de abril de 2023

Aceptado: 18 de agosto de 2023

Publicado: 22 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40919-7

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