Desentrañando el proceso de escisión del ADN de la enzima Sau3AI

Sau3AI es una enzima de restricción de tipo II ampliamente utilizada para la manipulación genética, como la construcción de bibliotecas de genomas. Sau3AI consta de dos dominios, el dominio N-terminal (Sau3AI-N) y el dominio C-terminal (Sau3AI-C). Aún no está claro cómo estos dos dominios trabajan juntos para cortar el ADN.

Recientemente, un equipo de investigación dirigido por el Prof. YU Feng del Instituto de Investigación Avanzada de Shanghai (SARI) de la Academia de Ciencias de China y el Prof. HE Jianhua de la Universidad de Wuhan informaron sobre un mecanismo de autoactivación en el que el dominio C-terminal Sau3AI abre el Dominio catalítico N-terminal a través de efectos alostéricos para lograr la escisión de sitios específicos del ADN.

Los resultados se publicaron en Structure el 30 de agosto.

Debido a la actividad de escisión del ADN, Sau3AI no se puede expresar en Escherichia coli y, por lo tanto, se utilizó un mutante del sitio catalítico, Sau3AI-E64A, para la expresión exógena y la investigación estructural. La estructura cristalina del mutante Sau3AI-E64A revela que cuando el ADN no está unido, una región de bucle (333-342) del dominio C-terminal cuelga sobre el sitio de unión del ADN del dominio N-terminal, impidiendo que el dominio N-terminal se una a ADN.

El análisis del dominio C-terminal de Sau3AI y la estructura del complejo de ADN indicó que la región del bucle (261-268 y 280-295) del dominio C-terminal se alteró significativamente después de la unión al ADN, lo que implica que Sau3AI puede sufrir cambios conformacionales después del dominio C-terminal. El dominio se une al ADN.

Además, los investigadores llevaron a cabo un experimento de cambio de gel en los mutantes de residuos de aminoácidos clave de unión al ADN (K257A, S424A y T435A) en el dominio C-terminal para confirmar que el ADN de unión al C-terminal desempeña un papel crucial en la activación de la actividad catalítica de N- dominio terminal. Estos resultados sugieren que el dominio C-terminal activa la actividad enzimática del dominio N-terminal a través de efectos alostéricos.

Los investigadores sugirieron que Sau3AI es una enzima de restricción de tipo IIE, pero a diferencia de otras enzimas de restricción de tipo IIE, es monomérica en lugar de homodímera. Dos dominios diferentes en Sau3AI desempeñan un papel similar a los homodímeros en otras enzimas de restricción de tipo IIE, lo que sugiere que Sau3AI representa una nueva subclase de enzimas de restricción de tipo IIE.