Trasplante de FVIII/ET3

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4206 (2023) Citar este artículo

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La hemofilia A es el trastorno hemorrágico ligado al cromosoma X más común que afecta a más de medio millón de personas en todo el mundo. Las personas con hemofilia A grave tienen niveles de FVIII de coagulación <1% y experimentan hemorragias espontáneas debilitantes y potencialmente mortales. Los avances en la terapéutica de la hemofilia A han mejorado significativamente los resultados de salud, pero el desarrollo de anticuerpos inhibidores del FVIII y las hemorragias intermenstruales durante la terapia aumentan significativamente la morbilidad y mortalidad de los pacientes. Aquí utilizamos fetos de oveja en el equivalente humano de 16 a 18 semanas de gestación, y mostramos que el trasplante prenatal de células placentarias humanas (107 a 108/kg) diseñadas mediante bioingeniería para producir una proteína FVIII optimizada produce una elevación considerable de los niveles plasmáticos de FVIII que persiste durante >3 años después del tratamiento. Las células se injertan en órganos principales y ninguno de los receptores genera respuestas inmunes ni a las células ni al FVIII que producen. Por tanto, estos estudios dan fe de la viabilidad, la ventaja inmunológica y la seguridad del tratamiento de la hemofilia A antes del nacimiento.

La hemofilia A (HA), el trastorno hemorrágico ligado al cromosoma X más común, se produce en 24,6 de cada 100.000 nacimientos masculinos vivos y afecta a más de medio millón de personas en todo el mundo1. Las personas con HA grave (PHA) tienen <1% de los niveles plasmáticos normales de actividad de FVIII y sufren hemorragias espontáneas potencialmente mortales, incluidos hematomas de tejido conectivo/músculo, hemorragias internas y hemartrosis que conducen a artropatías crónicas debilitantes2. A pesar de los últimos avances en las terapias actuales, que han mejorado sustancialmente el estándar de atención3, la carga de enfermedad en PHA sigue siendo alta, como enfermedad de las articulaciones, desarrollo de anticuerpos inhibidores en 25-40% de los pacientes, dentro de los primeros 50 días de exposición. al FVIII, y la prevención de hemorragias irruptivas y/o potencialmente mortales sigue siendo un desafío4,5.

Un estudio reciente demostró que para quienes nacen con hemofilia, las posibilidades de vivir una vida de duración y calidad normales se reducirán en un 33% en los países de altos ingresos y en un 93% en los países de bajos ingresos1. Estas aleccionadoras estadísticas demuestran que todavía existen necesidades clínicas urgentes no satisfechas que requieren el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para aumentar la supervivencia y la calidad de vida de estos pacientes.

El tratamiento de trastornos genéticos durante el período prenatal mediante trasplante in útero (IUTx) se ha realizado de forma segura durante décadas en humanos bajo uso compasivo6. Recientemente, se iniciaron ensayos clínicos que reclutaron sujetos para establecer la seguridad y viabilidad del uso de IUTx para tratar fetos con α-talasemia (NCT02986698), osteogénesis imperfecta (NCT03706482) o enfermedades por almacenamiento lisosomal (NCT04532047). Estos ensayos dan fe del tan necesario cambio de perspectiva sobre cómo se puede tratar a los pacientes con trastornos monogénicos y han establecido aún más la seguridad de este tipo de procedimientos tanto para las mujeres embarazadas como para el sujeto afectado7.

Aproximadamente el 70% de las personas con HA tienen antecedentes familiares de la enfermedad, lo que permite el diagnóstico y la intervención prenatal. El desarrollo de terapias prenatales capaces de proporcionar niveles de FVIII que sean curativos o suficientes para convertir un trastorno hemorrágico grave y potencialmente mortal en un fenotipo leve, al mismo tiempo que se induce tolerancia inmune al producto de FVIII y, por lo tanto, se elimina el riesgo de formación de inhibidores de FVIII. , tendría un impacto beneficioso importante en la esperanza de vida y la calidad de vida de los pacientes con HA, y transformaría el estándar de atención en el tratamiento de HA8,9.

Si bien la terapia génica in útero se ha mostrado muy prometedora en estudios preclínicos10, la transducción de células in vitro permite salvaguardias en la producción que no son posibles con la inyección directa del vector y elimina el riesgo de transducir inadvertidamente tejidos/células no deseadas, por ejemplo, las de la línea germinal. Además, IUTx que utiliza células que proliferan fisiológicamente in vivo y secretan niveles clínicamente terapéuticos de FVIII es un enfoque prometedor y seguro para proporcionar una corrección permanente/a largo plazo de HA6. Recientemente hemos informado que las células placentarias humanas (PLC) son una excelente plataforma celular para producir y secretar FVIII in vivo cuando se transducen con un lentivector que codifica un FVIII modificado por bioingeniería con codones mieloides optimizados (PLC-mcoET3)11. Aquí, utilizando ovejas de tipo salvaje como modelo animal grande de IUTx, demostramos que la administración de PLC-mcoET3 en el equivalente de 16 a 18 semanas de gestación (gw) en humanos dio como resultado niveles elevados de FVIII en plasma que excedieron los de los controles no. -Animales IUTx en >48,4 ± 12,3%, durante >3 años después del nacimiento, a pesar del rápido y considerable aumento de peso, sin evidencia de toxicidad relacionada con la terapia, ni el desarrollo de IgG anti-FVIII/ET3, inhibidores de FVIII o Células Th1 o Th2 específicas de ET3. Además, demostramos que los receptores tratados con IUTx no desarrollaron inmunidad ni anticuerpos anti-HLA contra el PLC humano trasplantado, pero mantuvieron una fuerte reactividad a antígenos extraños. Los análisis de ARN y ADN demostraron el injerto y la expresión continua del mcoET3 codificado por el vector en todos los órganos principales. Esta terapia también resultó en la ausencia de sangrado en una oveja HA, a pesar de un parto difícil. Por tanto, estos estudios dan fe de la viabilidad, la ventaja inmunológica y la seguridad del tratamiento de la HA durante el período prenatal.

Un total de 25 animales fueron trasplantados en el útero (IUTx) con células mesenquimales (PLC) derivadas de placenta humana transducidas con un vector lentiviral que codifica mcoET3, un transgén de FVIII12 diseñado mediante bioingeniería y optimizado para codones mieloides (PLC-mcoET3) en 59-65 días de gestación (gd), que corresponde a ~16–18 gw en humanos, a dosis estimadas de 107–108 células/kg, como se detalla en el diseño del estudio y en la Tabla complementaria 1. El banco de células maestras PLC-mcoET3 utilizado en este estudio fue previamente descrito en cuanto a aislamiento, cultivo, caracterización fenotípica, antes y después de la transducción11. Los animales fueron seguidos durante uno (n = 13) a tres (n = 8) años después de la IUTx. La evaluación de la actividad plasmática del FVIII a intervalos durante la duración del estudio, expresada como % de aumento con respecto al grupo de control no trasplantado, mostró que, durante el primer año, los animales tratados exhibieron un aumento general del 54,3 ± 7,5 % (n = 13) en el plasma. actividad de FVIII (Fig. 1a); Es de destacar que la hemostasia normal requiere al menos el 25% de la actividad del factor VIII. Es importante destacar que la elevada actividad del FVIII se mantuvo a pesar del crecimiento exponencial de los animales, que pesaban ~0,1 kg en el momento del trasplante, 3,7 ± 0,34 kg al nacer y 62 ± 4,1 kg al año de edad (Fig. 1b). De 12 a 24 meses después del nacimiento, el aumento medio en la actividad del FVIII continuó estando en niveles de 47,4 ± 16,8% (n = 10), oscilando entre 14% y 191% en ocho de nueve animales, y uno no alcanzó 5 % de aumento de FVIII (Fig. 1c). La evaluación de ocho animales durante el tercer año después de la IUTx demostró un aumento medio general de la actividad del FVIII de 48,4 ± 12,3 %, y dos animales mostraron una actividad del FVIII de entre el 5 y el 20 % (Fig. 1d). Para determinar si el porcentaje de FVIII estaba disminuyendo significativamente con el tiempo después del trasplante, se realizó un análisis que evaluó las diferencias entre los niveles medios de aumento de la actividad de FVIII durante el primer y tercer año después del trasplante, y los resultados se muestran en la Figura complementaria 1. Todos menos uno. El receptor mantuvo (o no cambió significativamente) los niveles de actividad de FVIII a pesar del aumento constante de peso, que a los 36 meses alcanzó 124 kg y 95 kg para hombres y mujeres, respectivamente (Fig. 1b).

a La evaluación de los niveles de FVIII mediante ensayos de actividad de FVIII durante el año 1 después del nacimiento demostró que todos los animales tratados exhibieron un aumento en la actividad de FVIII en plasma que podría proporcionar una hemostasia normal (n = 13 animales; cada animal fue evaluado en n = 3 an = 6 puntos de tiempo diferentes, como lo indican los puntos/animal); b La curva de peso demostró que el aumento de la actividad del FVIII se mantuvo a pesar del crecimiento exponencial de los animales (n = 13 animales); c 2 años después del nacimiento, el aumento medio de la actividad del FVIII continuó siendo elevado en nueve animales y uno no logró alcanzar un aumento del 5% del FVIII (n = 10 animales; cada animal fue evaluado en n = 2 a n = 6 puntos temporales diferentes, como lo indican los puntos/animal); d Año 3 años después del nacimiento, seis de ocho animales mantuvieron un aumento considerable en la actividad del FVIII, mientras que la actividad del FVIII en los otros dos estuvo entre el 5 y el 20% (n = 8 animales; cada animal fue probado en n = 2 an = 6 puntos de tiempo diferentes, como lo indican los puntos/animal); e Confirmación de la presencia de proteína ET3 en el plasma de los animales tratados mediante LC-MS, lo que demuestra que el aumento en la actividad del FVIII detectado por los ensayos de actividad del FVIII se debió a la presencia de la proteína ET3 en circulación. Se utilizó LC-MS como enfoque dirigido y la intensidad exclusiva normalizada refleja el valor de intensidad resumido de los péptidos asociados únicamente con esta proteína y, por lo tanto, proporciona la abundancia relativa de ET3 dentro de cada oveja. Las barras en negrita representan la media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para confirmar la presencia de proteína ET3 en el plasma de los animales tratados, se realizó cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS). Se utilizó un análisis independiente de los datos para proporcionar la abundancia relativa de ET3 dentro del plasma de cada animal y demostró que el aumento en la actividad del FVIII era consistente con la presencia de la proteína ET3 en circulación. La Figura 1e muestra la intensidad exclusiva que refleja el valor de intensidad resumido de los péptidos asociados únicamente con esta proteína.

Anteriormente hemos demostrado que la administración de proteína ET3 o hFVIII a ovejas juveniles de tipo salvaje induce una fuerte respuesta inmune anti-ET3/FVIII IgG a partir de la semana 2 después de la infusión y conduce al desarrollo de anticuerpos inhibidores13. Para investigar si la proteína ET3 circulante proporcionada por las células transducidas inducía anticuerpos anti-ET3 en animales IUTx, se realizaron ELISA de IgM e IgG específicos de ET3 en plasma en múltiples momentos después del nacimiento. Como se muestra en las figuras 2a, b, durante el primer año después de la IUTx, ninguno de los animales tratados desarrolló anticuerpos IgM o IgG anti-ET3. De manera similar, durante el segundo año (Fig. 2c), todos los receptores menos uno continuaron sin anticuerpos IgG anti-ET3. El único animal (17010) que exhibió un título bajo (1:20) de anticuerpos IgG anti-ET3 a los 18 meses después del trasplante, fue seguido de cerca con pruebas posteriores de anticuerpos IgG anti-ET3, y los datos mostraron que el anticuerpo IgG anti-ET3 fue transitorio o un artefacto del ensayo. En la figura 2d se muestran los resultados detallados de las pruebas de anticuerpos IgG anti-ET3 realizadas entre 4 y 24 meses en este animal.

Se realizaron ELISA específicos anti-ET3 en diluciones seriadas de plasma de animales IUTx en múltiples momentos después del nacimiento (3–8 y 18 meses) para investigar si la proteína ET3 circulante inducía: a IgM (n = 13 animales) o b anticuerpos IgG en Animales IUTx: cada animal se probó al menos dos veces, en (b) uno anterior (n = 13 animales) y en (c) un momento tardío (n = 12 animales), y para cada momento los ELISA se realizaron por triplicado. Los títulos de anticuerpos positivos se definieron como la dilución de plasma con un valor de absorbancia > 2 DE por encima de la DO media de los ELISA realizados con plasma de oveja de control (línea de puntos). Durante el primer año después de la IUTx, ninguno de los animales tratados desarrolló anticuerpos IgM o IgG anti-ET3, pero durante el año 2, se detectó anticuerpo IgG anti-ET3 de título bajo (1:20) en un animal (17010). Este animal fue seguido de cerca con pruebas posteriores de anticuerpos IgG anti-ET3, y los datos mostraron que (d) el anticuerpo IgG anti-ET3 medido en diferentes momentos (n = 5) era un anticuerpo no inhibidor transitorio, ya que los niveles de FVIII se mantuvieron alto, o un artefacto del ensayo ya que las muestras posteriores de este animal carecían de IgG anti-ET3. Los datos se muestran como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar si los animales tratados habían desarrollado células T de memoria específicas de ET3, se realizaron ensayos ELISpot de IFN-γ e IL-4 para determinar la presencia, la intensidad de la secreción y las frecuencias de células T de memoria específicas de ET3 reactivas. Ninguno de los receptores de IUTx albergaba linfocitos Th1 o Th2 específicos de ET3 (Fig. 3a, b respectivamente), mientras que sus linfocitos mantenían la capacidad de reaccionar y secretar IFN-γ e IL-4 cuando se estimulaban con fitohemaglutinina-L (PHA-L). , demostrando así que sus linfocitos eran funcionales, capaces de activarse y de secretar las citoquinas analizadas.

Se realizaron ensayos ELISpot de IFN-γ yb IL-4 para determinar la presencia de células T de memoria reactivas específicas de ET3. Los ensayos se realizaron por duplicado y a partir de células recolectadas de cada animal (n = 13 animales) en al menos dos momentos diferentes que oscilaron entre 5 y 20 meses después del nacimiento. Una respuesta positiva se definió mediante un índice de estimulación >2 y >10 SFU/2 × 105 PBMC (línea de puntos). Los receptores de IUTx (n = 13 animales) no tenían linfocitos Th1 o Th2 específicos de ET3, mientras que sus linfocitos mantuvieron la capacidad de reaccionar y secretar IFN-γ e IL-4 cuando se estimularon con fitohemaglutinina-L (PHA-L); c Ninguno de los linfocitos de los animales IUTx (n = 13 animales) proliferó en presencia de PLC-mcoET3 (T) del mismo donante o PLC no transducido (NT) del mismo donante, cuando se probaron mediante MLR unidireccionales, pero se mantuvieron respuesta proliferativa significativa a PBMC humanas de terceros. Para cada animal, los ensayos de MLR se realizaron por triplicado en dos momentos diferentes. Los datos se muestran como media ± SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para determinar diferencias significativas. Se consideró significativo p ≤ 0,05. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; ****p ≤ 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar si PLC-mcoET3 era inmunogénico y podía sensibilizar a los receptores fetales a la terapia administrada, se realizaron reacciones de linfocitos mixtos (MLR) unidireccionales cultivando conjuntamente células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los receptores con (1) PLC del mismo donante. -mcoET3; (2) PLC no transducido del mismo donante; (3) PBMC xenogénicas (humanas de terceros), o (4) PBMC propias individuales para establecer el índice de estimulación inicial. Ninguno de los receptores de IUTx tuvo cambios significativos en la proliferación de PBMC cuando se cocultivaron con PLC transducido o PLC no transducido y se compararon con el cocultivo con PBMC individuales (Fig. 3c). Para investigar si las PBMC del receptor de IUTx se habían vuelto anérgicas, las PBMC del receptor de IUTx se estimularon con PBMC humanas de terceros y exhibieron una proliferación celular significativamente mayor en comparación con el control respectivo, lo que demuestra que las PBMC analizadas eran funcionales y mantenían la capacidad de reconocer y responder a agentes extraños. antígenos (Fig. 3c).

Para explorar si la administración de PLC-mcoET3 provocó una respuesta inmune humoral que condujo a la formación de anticuerpos IgG HLA Clase I y/o Clase II, primero se utilizó la secuenciación para definir el tipo PLC HLA utilizado en este estudio: A*02,24; B*18,51; C*02,07; DRB1*04,16; DRB4*01; DRB5*02; DQB1*03(DQ7),05; DQA1*01,03; DPA1*01; DPB1*04. A continuación, se realizaron ensayos de perlas agrupadas en fase sólida utilizando un sistema multiplex Luminex 200, modificado para la detección de anticuerpos en suero de oveja. Los resultados de esta evaluación mostraron que ninguno de los receptores de IUTx había sido sensibilizado contra las células del donante, y su estado de anticuerpos reactivos (PRA) del panel se consideró negativo (Fig. 4a). Es de destacar que un animal (17021) fue reactivo al HLA-B45, pero dado que las células trasplantadas no contienen este antígeno HLA, se consideró un anticuerpo no específico. Otro animal (18007) también mostró múltiples anticuerpos HLA xenogénicos no específicos. Por lo tanto, también investigamos si los animales (de control) que nunca fueron trasplantados con células humanas tenían anticuerpos xenogénicos de origen natural, que presentaban reactividad cruzada con las dianas de perlas HLA humanas. Los resultados mostraron que todos los controles tenían anticuerpos xenogénicos con una amplia gama de MFI (Fig. 4a). La evaluación de los anticuerpos anti-HLA-II en los sueros de animales trasplantados y animales de control no trasplantados mostró que ninguno de los animales exhibió un PRA positivo, o al menos un PRA positivo específico para las células trasplantadas (Fig. 4b).

Se muestran los resultados de las intensidades de fluorescencia medias (MFI) sin procesar de ensayos de perlas agrupadas en fase sólida, modificados para la detección de (a) anticuerpos HLA-I y (b) HLA-II en sueros de ovejas IUTx (n = 13 animales). También se incluyen los resultados de perlas de control positivo y animales de control no tratados. Para cada animal, los puntos corresponden al MFI de cada cuenta en el panel. Si los valores de MFI en ≥2 cuentas eran negativos, su estado de anticuerpos reactivos (PRA) en el panel se consideró negativo. En ninguno de los animales trasplantados se encontró que tuviera una PRA positiva específica para las células trasplantadas; c Alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) (n = 13 animales); d valores de hematocrito (n = 13 animales); y los leucocitos (n = 13 animales) se analizaron en diferentes momentos después del nacimiento, cada uno representado por un punto. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (ns) entre los animales tratados con IUTx y un grupo de animales de control (p ≤ 0,05). Los datos se muestran como media ± SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett para determinar diferencias significativas entre cada animal y el animal de control. Las líneas de puntos indican el rango normal superior de AST y ALT. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar si se indujeron alteraciones hepáticas o hematológicas como resultado de IUTx, se analizaron los recuentos de glóbulos blancos (WBC), hematocritos y las enzimas hepáticas, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) a intervalos después del nacimiento. Todos los animales trasplantados mantuvieron niveles normales de ALT y AST (Fig. 4c) y tuvieron hematocritos (Fig. 4d) y WBC (Fig. 4e) dentro del rango normal, que no difirieron significativamente del grupo no trasplantado dentro de la manada.

Para determinar los sitios y el porcentaje relativo de injerto de PLC-mcoET3 en diferentes órganos de animales tratados prenatalmente (n = 4), los receptores fueron sacrificados al nacer, lo que corresponde a aproximadamente 3 meses después del trasplante. De particular importancia, a uno de estos animales se le había diagnosticado HA durante la gestación, utilizando ADN aislado de células de líquido amniótico y polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) PCR14. El diagnóstico también se confirmó al nacer mediante ADN de fibroblastos de la piel. El animal HA nació muerto como resultado de complicaciones del parto y, a pesar del proceso traumático del parto, en la necropsia, el animal no mostró evidencia del sangrado anormal extenso, que se ha reportado en esta línea de animales HA14,15.

Se realizó RT-qPCR utilizando cebadores específicos de mcoET3 en ARN aislado del hígado, pulmón, bazo y timo de este animal HA y de los otros receptores de IUTx sacrificados. Para crear una curva estándar para la cuantificación, se realizó RT-qPCR en ARN aislado de diferentes porcentajes de PLC-mcoET3 mezclado con células estromales de oveja. Luego, los resultados obtenidos de los diferentes tejidos se extrapolaron a porcentajes utilizando la curva estándar. En la Fig. 5a se representan los porcentajes de injerto de PLC-mcoET3 en órganos de animales tratados, lo que demuestra que las células se injertaron en todos los órganos analizados. Las mismas muestras de tejido recolectadas de animales de control no tratados no mostraron amplificación diana. Se realizó qPCR utilizando cebadores específicos de Alu humano en ADN extraído de los mismos tejidos para determinar la presencia general de células humanas transducidas y no transducidas. Se utilizó una curva estándar generada a partir de ADN extraído de tejidos de oveja con cantidades crecientes de ADN humano (0, 0,25, 0,5, 1, 5 y 10 ng) hasta un total de 100 ng de ADN por muestra para extrapolar la cantidad de ADN genómico humano. presente en cada animal y en cada órgano (Figura complementaria 2). Todos los animales y los tejidos analizados contenían ADN humano. Si bien se encontraron cantidades similares de ADN humano en el bazo y el timo, diferentes animales diferían en las cantidades de ADN humano presentes en el hígado y los pulmones (Figura complementaria 2).

una RT-qPCR (por triplicado) (n = 4 animales, n = 4 experimentos) utilizando cebadores específicos de mcoET3 en ARN aislado de diferentes órganos. Los animales tenían niveles similares de PLC-mcoET3 injertado en todos los órganos analizados; 18.002 tenían niveles estadísticamente significativos más altos que 18.008 en el hígado, los pulmones y el timo; b la cuantificación hepática de células humanas Ku80 positivas mediante inmunohistoquímica confirma la presencia de células PLC del donante en todos los animales (con menos sensibilidad que mediante RT-qPCR); c – f imágenes representativas de la tinción con Ku80 en hígado (n = 3 animales) (flechas blancas = células positivas); c controlar los animales no trasplantados; d – f animales IUTx (n = 3 animales); g control de isotipo y h presencia de células productoras de ET3/FVIII entre los hepatocitos y entrelazadas con los sinusoides hepáticos en animales IUTx HA después de la tinción con anti-FVIII humano. Dado que los animales HA con esta mutación carecen del antígeno del factor VIII en todos los tejidos (material de reacción cruzada negativo), la presencia de ET3/FVIII detectada resulta de la producción de ET3/FVIII por las células trasplantadas. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal Olympus Fluoview FV1000 con objetivo de aceite Olympus UPlanFLN-40 × / 1,30 (barras de escala: c – e = 100 µm; f – h = 50 µm). El porcentaje de células positivas para los diferentes marcadores se calculó después de contar un mínimo de 1500 núcleos DAPI+ (n = 3 experimentos). Los datos se muestran como media ± SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para determinar diferencias significativas (p ≤ 0,05 se consideró significativo). Hígado *p = 0,0406; Pulmón *p = 0,0182 (18002-18008) y *p = 0,0199 (18002-1002); an ns valores de p en secuencia de izquierda a derecha: hígado p = 0,1685; 0,8285; >0,999; 0,1818; 0,8041; bazo p = 0,0763; 0,0702; 0,1244; >0,9999; 0,9906; 0,9854; pulmón p = 0,0845; 0,8127; 0,8366; >0,9999; timo p = 0,9818; 0,8695; 0,0755; 0,144; 0,9785. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que el hígado es un sitio importante de producción de FVIII, la distribución y localización de las células trasplantadas en este órgano también se examinaron mediante inmunohistoquímica, utilizando un anticuerpo específico para la proteína nuclear humana, Ku80, y los portaobjetos se cuantificaron utilizando la imagen J (Fig. 5b). . En las figuras 5c-f se pueden ver imágenes representativas de la tinción con Ku80 en el hígado. La figura complementaria 3 también muestra imágenes representativas de la tinción con Ku80 en el timo de estos animales.

Además, y para visualizar mejor la ubicación de PLC-mcoET3 dentro del tejido hepático y cualquier alteración histomorfológica causada por PLC-mcoET3 en el sitio del injerto, también se realizó tinción con Ku80 utilizando el cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB). Los núcleos oscuros positivos para Ku80 de las células humanas se pueden identificar fácilmente dentro del parénquima de las diferentes secciones del hígado (Fig. 6c-f). No hay evidencia de proliferación clonal de PLC-mcoET3 ni de alteración de la arquitectura celular del hígado en el lugar donde se alojaron las células.

a Imágenes representativas (izquierda: barra de escala = 100 µm y derecha: barra de escala = 50 µm) de tinción para la proteína nuclear específica humana Ku80 (marrón oscuro) en secciones de hígado humano; b Imágenes representativas (izquierda: barra de escala = 100 µm y derecha: barra de escala = 50 µm) de ovejas de control no trasplantadas que demuestran la ausencia de células humanas; c – f Imágenes representativas (izquierda: barra de escala = 100 µm y derecha: barra de escala = 50 µm) de tinción para la proteína nuclear Ku80 específica humana en animales IUTx (n = 4 animales, cada panel es un animal diferente), que demuestran la Presencia de células humanas. Los núcleos oscuros de las células humanas pueden verse dentro del parénquima de las diferentes secciones del hígado, sin mostrar signos de alteración de la arquitectura celular del hígado. Se analizaron portaobjetos de todos los animales de prueba y controles negativos en al menos tres experimentos diferentes. Para eliminar el sesgo del observador, se utilizó un script ImageJ para procesar tres regiones de interés (ROI) diferentes e identificar células positivas. El script desconvolucionó cada imagen de ROI en una imagen H&E y una imagen DAB, luego consideró las celdas positivas usando umbrales de tamaño, circularidad y color. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio de campo claro LEICA DM4000B utilizando objetivos de 10 × y 20 ×.

La producción y presencia de proteína ET3 en el hígado también se determinó en el animal IUTx HA (Fig. 5g, h). Dado que los animales con esta mutación carecen del antígeno del factor VIII (material de reacción cruzada negativo) (Figura 4 complementaria), la detección de FVIII/ET3 en el animal IUTx HA resulta de la producción de ET3/FVIII por las células trasplantadas presentes en el órgano. Es de destacar la presencia de células productoras de ET3/FVIII entre los hepatocitos y entrelazadas con los sinusoides hepáticos. La figura complementaria 5 muestra células positivas para ET3/FVIII ubicadas en el timo del animal HA.

La actividad del FVIII en plasma de animales IUTx permaneció elevada durante el tercer año de análisis, lo que sugiere que PLC-mcoET3 persiste a largo plazo en los tejidos injertados. Para verificar que PLC-mcoET3 estuviera presente a largo plazo en los diferentes órganos, se sacrificaron seis animales que no eran portadores de HA ni reproductores machos entre 2,3 y 5 años después de la IUTx (Tabla complementaria 1). La qPCR utilizando cebadores específicos de Alu humano en ADN extraído del hígado, pulmón, bazo y timo se realizó como se describe anteriormente, y los resultados que se muestran en las figuras 7a a e demuestran que el ADN humano todavía estaba presente en la mayoría de los órganos analizados. Las mismas muestras de tejido recolectadas de animales de control no tratados no mostraron amplificación diana. Para confirmar que el ADN humano detectado correspondía a células humanas injertadas y determinar su ubicación, también se examinaron mediante inmunohistoquímica secciones de tejido de hígados de estos animales, utilizando anticuerpos específicos para la proteína nuclear humana Ku80 y la albúmina humana. En las figuras 7f-k se pueden ver imágenes representativas de tejidos hepáticos de humanos, ovejas de control no trasplantadas y animales IUTx. Los núcleos oscuros de las células humanas se pueden identificar fácilmente cerca de los sinusoides hepáticos, mientras que ninguno de los hepatocitos de los portaobjetos analizados es positivo para la albúmina humana.

a – e qPCR utilizando cebadores específicos de Alu humano realizados por triplicado en ADN extraído de hígado, pulmón, bazo y timo (n = 6 animales) entre 2,3 y 5 años después de la IUTx; cantidad de ADN humano extrapolada de una curva estándar que consiste en ADN de oveja con (0,25, 0,5, 1, 5 y 10 ng de ADN humano de PLC hasta un total de 100 ng de ADN por muestra) o sin ADN humano. Todos los tejidos analizados contenían ADN humano; las mismas muestras de tejido de animales control no tratados no mostraron amplificación diana; b – e Datos individuales del contenido de ADN humano encontrado en órganos de animales individuales representados en (a); f – k Imágenes representativas de secciones de tejido hepático que confirman la presencia/ubicación de células humanas mediante IHC con anticuerpos contra la proteína nuclear humana, Ku80, (marrón oscuro) y albúmina humana (rojo); f Sección de tejido hepático humano que muestra los núcleos oscuros positivos y la albúmina citoplasmática en rojo; g Control de hígado de oveja no trasplantado que muestra ausencia de núcleos humanos oscuros o albúmina humana citoplasmática. h – k Secciones de tejido hepático de animales IUTx (n = 4 animales), se pueden ver núcleos humanos oscuros intercalados entre hepatocitos cerca de los sinusoides hepáticos, mientras que ninguno de los hepatocitos en los portaobjetos analizados es positivo para albúmina humana. Los portaobjetos de todos los controles positivos y negativos se tiñeron en tres experimentos diferentes y los animales de prueba se analizaron en al menos tres regiones de interés distintas utilizando secuencias de comandos ImageJ. Todas las imágenes se adquirieron en un microscopio de campo claro LEICA DM4000B con un objetivo de 20 aumentos. Los datos se muestran como media ± SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para determinar diferencias significativas y se consideró significativo p ≤ 0,05. **p = 0,0016, ****p = <0,0001, p = 0,7316 hígado-pulmón; p = 0,5619 hígado-bazo; p = 0,1072 pulmón-bazo; p = 0,0713 bazo-timo. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar que las células injertadas todavía estaban transcribiendo mcoET3, se realizó RT-qPCR en ARN aislado de hígado, pulmón, timo y bazo utilizando cebadores específicos de mcoET3, como se describió anteriormente (Figuras complementarias 6a, b-e). Además, también se analizó mediante RT-qPCR el ARN aislado de tejidos reproductivos y de ganglios linfáticos torácicos y mesentéricos (Figura complementaria 6a, f – h).

Para investigar si el injerto de PLC-mcoET3 en los diferentes tejidos había causado efectos adversos, se realizó tinción H&E en secciones de tejidos de todos los animales sacrificados y los portaobjetos se enviaron a un patólogo animal certificado. Los resultados no mostraron evidencia de toxicidad relacionada con los lentivirales o del procedimiento en ninguno de los tejidos examinados. Además, no hubo cambios en la arquitectura del tejido, formación de tejido ectópico, desarrollo tumoral macroscópico o áreas de células atípicas o focos de hiperplasia o neoplasia. En la Fig. 8 se pueden ver imágenes representativas de estas secciones de tejido.

Imágenes representativas de tinción H&E de secciones de tejido de animales IUTx (n = 10 animales) que no demuestran cambios en la arquitectura del tejido ni en la tumorigénesis. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio Leica DM4000 B utilizando un objetivo de 10 ×.

Para investigar si el PLC-mcoET3 residente en el órgano asumía identidades consistentes con tipos de células específicas dentro de los órganos, se aisló ARN de los tejidos principales de los animales y se crearon bibliotecas de secuencias de ARN del transcriptoma, que se alinearon con las bibliotecas de Homo sapiens después de eliminar cualquier posible cruce. -reactividad con transcritos ovinos. También se aisló ARN de PLC-mcoET3 antes del trasplante y se crearon bibliotecas de secuencias de ARN transcriptómicas. Las transcripciones de PLC-mcoET3 se compararon con transcripciones humanas que se sabe que se expresan en células específicas de órganos y con las transcripciones humanas encontradas en los mismos órganos de los animales trasplantados. Los resultados se pueden encontrar en las Tablas complementarias 2 a 6, que representan transcripciones reguladas al alza específicas del hígado, los pulmones, el tímico y los ovarios/testículos humanos. Estos resultados muestran que, aunque varios transcritos específicos de células estaban regulados positivamente en cada tejido, no estaba presente una proliferación de transcriptomas como la de una célula completamente diferenciada. Es importante destacar que estos análisis también confirmaron que la PLC-mcoET3 presente en los tejidos reproductivos no se debía a la contribución de estas células trasplantadas a la línea germinal durante el desarrollo fetal.

También se realizó inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos para proteínas humanas seleccionadas codificadas por los transcritos regulados positivamente en secciones de hígado de los animales que mostraban el mayor número de esos transcritos de hígado humano, y en las Figs. 7 y 9. Se puede ver en detalle una imagen representativa de células positivas para LYVE-1 dentro del endotelio de los sinusoides hepáticos en uno de los animales trasplantados (Fig. 9c, d). Si bien ninguno de los hepatocitos en los portaobjetos analizados es positivo para la albúmina humana (Fig. 7h-k), se encontró que algunos hepatocitos eran positivos para la enzima del ciclo de la urea CPS1, y en las Fig. 9e-i se muestran imágenes representativas.

una imagen representativa de la tinción con LYVE-1 de una sección de tejido hepático humano que muestra células endoteliales sinusoidales del hígado (LSEC) teñidas en oscuridad; como referencia, algunas de las sinusoides están marcadas con líneas de puntos (barra de escala = 50 µm); b Imagen representativa de la tinción con LYVE-1 de una sección de tejido hepático de control de ovejas no trasplantadas, que confirma la ausencia de LSEC humanas (barra de escala = 50 µm); c Imagen representativa de la tinción con LYVE-1 de una sección de tejido de hígado de oveja IUTx en la que se encontraron transcripciones de LYVE-1 (n = 5 animales analizados) que demuestra la presencia de células humanas similares a LSEC que expresan LYVE-1 (barra de escala = 100 µm ); d ampliación del rectángulo punteado (barra de escala = 50 µm) en (c) que muestra en detalle las celdas LYVE-1+ que están marcadas con puntas de flecha negras; (e – i) Imágenes representativas de la tinción de la enzima del ciclo de la urea humana CPS1 (rosa) de secciones de tejido hepático (barras de escala = 50 µm); e Sección de tejido de hígado humano con hepatocitos positivos para CPS1 (en rosa); f Sección de tejido hepático de control de ovejas no trasplantadas, lo que confirma la ausencia de hepatocitos que expresan CPS1 humano; g – i Imágenes representativas de secciones de tejido hepático de animales IUTx en las que se encontraron transcripciones para CPS1 (n = 4 animales) que muestran varios hepatocitos positivos para CPS1 humano. Se analizaron portaobjetos de todos los controles positivos y negativos y de los animales de prueba al menos en tres áreas distintas en tres experimentos separados. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio de campo claro LEICA DM4000B.

El entusiasmo por el tratamiento de los trastornos genéticos durante la gestación se ha vuelto a despertar con el desarrollo de nuevas tecnologías de transferencia y edición de genes, la mejor comprensión del desarrollo fetal y las interacciones feto-maternas, los avances en la seguridad de las manipulaciones prenatales y la capacidad de producir y utilizar células derivadas pre/perinatales y/o células modificadas genéticamente16,17,18,19,20,21,22,23.

Si bien se han iniciado ensayos clínicos con IUTx para tratar trastornos monogénicos en los que los fetos corren riesgo de muerte y/o están amenazados por el desarrollo de patologías irreversibles, otras enfermedades que sería ideal tratar in utero son aquellas en las que una corrección mínima sería sustancialmente impactan la calidad de vida (CV) futura de los individuos afectados, y aquellos en los que es posible explotar el entorno inmunológico en el momento del tratamiento para prevenir la reacción inmune posnatal a las proteínas codificadas por transgenes6,9,17,24. También es fundamental que el diagnóstico genético prenatal esté disponible y sea confiable, y que la correlación entre genotipo y fenotipo pueda predecir el pronóstico clínico a largo plazo6,9,17,24. Por lo tanto, la HA es una enfermedad ideal para corregir prenatalmente, ya que el 70% de las PHA tienen antecedentes familiares de la enfermedad, se dispone de un diagnóstico prenatal confiable y el tipo de mutación en combinación con los antecedentes familiares puede predecir si los pacientes son propensos a desarrollar inhibidores. Además, un aumento de sólo el 5% del FVIII en circulación puede cambiar un fenotipo de hemorragia espontánea potencialmente mortal en un fenotipo apropiado para la actividad física leve, y un aumento del 5 al 15% puede soportar una actividad física de mayor riesgo, en la que Los eventos hemorrágicos sólo ocurren después de un traumatismo mayor o una cirugía8,9,17,25.

Aunque los productos y regímenes terapéuticos de FVIII más nuevos disponibles para la PHA han mejorado enormemente el estándar de atención y la calidad de vida para muchos, todavía existen necesidades médicas no satisfechas que requieren el desarrollo de enfoques terapéuticos novedosos para abordar los desafíos y las brechas en los tratamientos estándar2,26 ,27. Es importante destacar que el objetivo de una cura sigue sin alcanzarse. Por ejemplo, incluso con los mejores tratamientos profilácticos, todavía se producen hemorragias intermenstruales, lo que contribuye a la morbilidad a largo plazo. La carga del tratamiento, especialmente en pacientes pediátricos, es una realidad, ya que incluso con la vía de administración subcutánea, los tratamientos siguen siendo invasivos, tanto física como psicológicamente2. Además, el tratamiento profiláctico es de por vida y >30% de los PHA desarrollan inhibidores del FVIII28,29. Es importante destacar que tanto las personas con HA31 grave30 como no grave que desarrollan inhibidores tienen un mayor riesgo de mortalidad. También es de destacar que algunos pacientes pueden experimentar sangrado espontáneo que comienza durante el período neonatal o la infancia. Los informes muestran que el 9,5% de los recién nacidos con HA necesitan tratamiento de reemplazo dentro de las primeras 24 h después del nacimiento, y el 44% presenta un episodio de sangrado al mes26,27. Además, los lactantes sufren hemorragias craneales (24%), bucales (30%), de tejidos blandos (7%) y articulares (16,2%)26,27. Por lo tanto, incluso un aumento del 5% en la actividad del FVIII durante el período neonatal podría evitar episodios hemorrágicos tempranos. Por tanto, estos pacientes podrían beneficiarse enormemente de una intervención temprana.

Los ensayos clínicos en adultos que utilizan la terapia génica AAV (AAV-GT) demuestran la promesa de una cura en la edad adulta, o posiblemente en la adolescencia tardía, con un solo tratamiento, pero la disminución de los niveles de FVIII con el tiempo sugiere que se necesitarán tratamientos adicionales32. La inmunidad preexistente al AAV puede llegar hasta aproximadamente el 60%, según la edad del donante y el serotipo del AAV, lo que afecta gravemente la capacidad de la PHA para recibir dichas terapias. Las respuestas inflamatorias post-AAV-GT causan pérdida del efecto terapéutico, y la naturaleza episomal de AAV hace que la aplicación pediátrica de AAV-GT sea subóptima, ya que la proliferación de hepatocitos durante el crecimiento del hígado podría conducir a la dilución y pérdida de estas terapias dirigidas al hígado, mientras que la readministración es comprometido por el desarrollo de inmunidad a los componentes del AAV33. Además, cuando se administraron vectores AAV para administrar FIX y X en macacos de tipo salvaje en gestación temprana, la expresión sostenida de los factores de coagulación se correlacionó con la integración del vector AAV, aunque en ausencia de toxicidad clínica18. Por lo tanto, la administración de células durante la gestación que proliferan fisiológicamente in vivo y secretan niveles clínicamente terapéuticos de FVIII es un enfoque prometedor y seguro para proporcionar una corrección permanente/a largo plazo de HA6, ya que la transducción de células in vitro permite salvaguardias en la producción que no son posibles con la técnica directa. inyección de vector y elimina el riesgo de transducir inadvertidamente tejidos/células no deseadas, por ejemplo, las de la línea germinal.

La IUTx se ha realizado de forma segura en pacientes humanos, y muchos pacientes recibieron tres inyecciones espaciadas con 1 semana de diferencia, lo que demuestra que acceder al feto humano temprano varias veces, utilizando un enfoque mínimamente invasivo guiado por ultrasonido, plantea un riesgo mínimo34. Es importante destacar que durante la vida fetal, la activación del FX se produce predominantemente a través de la actividad del factor tisular, lo que lo hace en gran medida independiente del complejo de fosfolípidos FIXa/FVIIIa35. Como tal, el feto se desarrolla sin hemorragia, incluso si hay poco o ningún FVIII o FIX presente35,36,37. Por lo tanto, la hemostasia única del feto debería permitir que la IUTx se realice de forma segura para HA, como se demostró en un estudio de caso único que informó el resultado exitoso de la IUTx en un feto humano con HA grave, sin causar sangrado38. Los datos también sugieren que el receptor tenía tolerancia al FVIII38, pero nunca se publicó ningún seguimiento de este paciente.

Lo sorprendente es que, a diferencia de la hemofilia B, se han diseñado muy pocos estudios en animales para probar la eficacia y seguridad de las terapias prenatales para la HA. En un estudio, se inyectó en ratones un vector adenoviral que codifica FVIII. Se observaron niveles terapéuticos en el día 2 de vida, pero los niveles de FVIII se habían reducido siete veces para el día 15 y habían desaparecido para el día 2139. Recientemente, otros investigadores realizaron IUTx en el día embrionario 14,5 en fetos murinos de tipo salvaje utilizando células placentarias transducidas con FVIII. , pero la evaluación de los receptores solo se realizó mediante la expresión de GFP y no se investigaron los niveles de FVIII en circulación ni las consecuencias inmunológicas del abordaje40.

Aquí, informamos datos a largo plazo sobre la seguridad y eficacia de la administración de células diseñadas para secretar fVIII/ET3, en dosis clínicamente relevantes, en un modelo animal grande de IUTx. Debido a que el peso del feto de oveja en el momento de la IUTx es comparable al de los humanos en las primeras etapas de la gestación, y en la edad adulta iguala o supera al de los humanos, no sería necesario aumentar la dosis celular si la traducción a la clínica de estas terapias se consideran seguras. Además, la similitud entre el volumen plasmático total entre humanos y ovejas garantiza que los niveles terapéuticos a largo plazo de actividad del FVIII encontrados en el plasma de animales IUTx después del nacimiento serían comparables a los de los humanos, ya que tanto los humanos como las ovejas experimentan aumentos exponenciales en el volumen total. Volumen plasmático desde la vida fetal hasta la edad adulta. Los datos de este estudio muestran que la administración de PLC-mcoET3 al equivalente de 16 a 18 gw en humanos dio como resultado una actividad elevada del FVIII en plasma que excedió la de los animales de control no IUTx en >48,4 ± 12,3%, durante >3 años después del nacimiento. . Los niveles de actividad del FVIII determinados mediante ensayos de actividad del FVIII también se confirmaron mediante LC-MS, que, además, demostró que la proteína ET3 estaba presente en el plasma de los animales tratados. Además, en siete de ocho animales, los niveles de FVIII un año después de la IUTx no diferían significativamente de los de tres años después de la IUTx, y el único animal en el que los niveles de FVIII disminuyeron aún mantuvo niveles de FVIII >5% por encima de lo normal. . Curiosamente, no se detectaron niveles plasmáticos más altos de FVIII en animales que recibieron dosis celulares más altas o en células con mayor secreción de FVIII. Es importante destacar que ninguno de los animales tratados desarrolló IgM o IgG anti-FVIII/ET3, o células Th1 o Th2 específicas de ET3. Esto contrasta con lo informado en otro estudio con ovejas jóvenes que recibieron exactamente la misma terapia (PLC-mcoET3) por la misma vía de administración (IP), y en el que el 66 % de los animales desarrollaron IgG anti-FVIII/ET3 y niveles bajos. títulos de anticuerpos inhibidores anti-FVIII y anti-ET313.

También es de interés que los receptores tratados con IUTx no desarrollaron inmunidad ni anticuerpos anti-HLA contra el PLC humano trasplantado, pero mantuvieron una fuerte reactividad a antígenos extraños. Además, los parámetros hematológicos y las enzimas hepáticas fueron normales, lo que demuestra la ausencia de toxicidad hepática. Se encontró que PLC-mcoET3 se alojaba en todos los órganos principales analizados, sin provocar alteraciones histopatológicas, y la evaluación de la expresión de mcoET3 mediante RT-qPCR y del ADN genómico humano mediante qPCR en los mismos tejidos no solo confirmó el injerto a largo plazo de las células trasplantadas. , pero también demostró la transcripción continua del transgén.

Es de destacar que el análisis de RNA-seq para identificar cambios en el transcriptoma de PLC-mcoET3 injertado desde antes del trasplante hasta el de un transcriptoma comparable al de un tipo de célula específica de órgano demostró que, aunque varias transcripciones estaban reguladas positivamente, estas células nunca expresaron conjuntos de genes que coinciden con los de las células diferenciadas. Dado que el hígado de las ovejas pesa aproximadamente 1 kg, sería imposible excluir absolutamente la posibilidad de la existencia de células completamente diferenciadas. Sin embargo, es importante señalar que estas mismas regiones contenían células positivas para la proteína nuclear humana Ku80. En conjunto, los datos muestran que el PLC-mcoET3 trasplantado expresa algunas transcripciones y produce algunas de las proteínas del tejido donde se alojan, pero no puede confirmar la presencia de una célula específica de órgano diferenciada completamente funcional.

El estudio también muestra que dentro de las muestras analizadas, hubo diferencias significativas en los niveles de injerto de PLC-mcoET3 en los diferentes órganos y entre animales. Incluso si se analizaran múltiples muestras de cada animal/órgano, debido al gran volumen de los órganos, es difícil determinar si es posible extrapolar estos resultados a la totalidad de los órganos. Por tanto, la mejor lectura del resultado de la terapia son los niveles de actividad de FVIII detectados en el plasma de estos animales, que pueden medir verdaderamente la producción total de FVIII por las células injertadas.

Atestiguar la seguridad del procedimiento y la terapia también es un objetivo principal, y en este estudio los animales que se perdieron en el estudio se debieron a causas no relacionadas con el tratamiento o el procedimiento IUTx. Esto incluye los abortos tardíos en animales clonados con HA, ya que este problema ha sido bien documentado tras este tipo de tecnología de reproducción asistida, y no se debió al trasplante en sí41. Desafortunadamente, debido a que cuando se iniciaron estos estudios los portadores en la colonia de ovejas HA eran mayores y la clonación resultó en abortos espontáneos, no pudimos producir muchos animales HA mediante reproducción natural. El único animal HA tratado por IUTx nació muerto debido a complicaciones del parto. Sin embargo, a pesar del traumático proceso de parto, en la necropsia, el animal no mostró evidencia del sangrado anormal que se observa en esta línea de animales HA14,15, y se identificaron células productoras de ET3/FVIII en el hígado y el timo de este animal. .

Por tanto, estos estudios dan fe de la viabilidad, la ventaja inmunológica y la seguridad del tratamiento de la HA antes del nacimiento. Es importante destacar que IUTx con PLC-mcoET3 podría eliminar la necesidad de dosificación semanal, manteniendo al mismo tiempo niveles terapéuticos que excedieron el nuevo objetivo clínico sugerido de >15 % de FVIII, que pretende proporcionar una protección eficaz contra la mayoría de las hemorragias espontáneas25. Dado que 3 años después de la IUTx, los niveles plasmáticos promedio de FVIII estaban 48,4 ± 12,3% por encima del control, este enfoque también podría proporcionar factor suficiente para controlar otras hemorragias agudas, en particular, hemorragias subclínicas y aquellas asociadas con traumatismos, cirugía y/o o actividad física intensa25. Sin embargo, la confirmación de la corrección fenotípica mediante la evaluación de si la tasa de sangrado anualizada se reduce significativamente desde el inicio a lo largo de la vida de los animales HA, y la evidencia de que aún no hay una respuesta inmune presente en estos animales es imprescindible para determinar el verdadero impacto clínico de este control prenatal. acercarse.

Toda la investigación se realizó de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes y los estudios en animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Wake Forest (IACUC). Las placentas humanas desechadas se obtuvieron de partos a término después de un consentimiento informado por escrito y una compensación por su tiempo de acuerdo con las pautas de la Oficina de Protección de la Investigación Humana y aprobadas por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Facultad de Medicina de la Universidad Wake Forest.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Wake Forest. Todas las ovejas experimentales son una mezcla exógena de cepas Alpine White, Suffolk, Rambouillet y Merino y están alojadas en pastos cercados con acceso a refugios y/o establos en las instalaciones para animales grandes de la Facultad de Medicina de la Universidad Wake Forest bajo el cuidado veterinario del Animal. Programa de Recursos (ARP). Las ovejas reciben agua, alimentos adecuados para la estación y el estado de gestación, y suplementos como vitamina E, selenio y calcio. Los corderos reciben calostro de la madre o calostro artificial y se alimentan con biberón cuando es necesario. Las ovejas son vacunadas y examinadas periódicamente por veterinarios y/o técnicos veterinarios de ARP para garantizar el estado de salud y nutrición del rebaño. A los fetos de ovejas (n = 25), machos y hembras, se les inyectó PLC-mcoET3 por vía intraperitoneal a los 59–65 gd (gestación a término: 145–150 días), lo que corresponde a ~16–18 semanas de gestación en humanos, por inyección percutánea transabdominal guiada por ultrasonido utilizando una aguja espinal ecogénica de 152 mm y calibre 22 (Hakko Co, 6PTC22) como se informó anteriormente42, a dosis celulares de 107–4 × 108 células/kg en 500 uL de QBSF-60 (Quality Biologicals Inc. .NC0823508). Aunque HA es un trastorno ligado al cromosoma X y afecta predominantemente a hombres, en este caso el producto se administró tanto a hombres como a mujeres. De los 25 animales trasplantados, 13 estaban disponibles para evaluación a largo plazo (hasta 1 año) y ocho de estos animales fueron seguidos hasta 3 años; cuatro sólo fueron evaluados poco después del nacimiento (~3 meses después del trasplante), mientras que ocho se perdieron durante el estudio. Todos los animales fallecidos/eutanasiados tuvieron complicaciones médicas no relacionadas con el procedimiento o la administración del producto. Al evaluar la eficacia del tratamiento, las pruebas se realizaron a ciegas respecto del estado del tratamiento en animales. Para garantizar la significación estadística, el número de animales se determinó mediante análisis de potencia utilizando G*Power v3.1.9.2.

Puede encontrar información adicional relacionada con el diseño del estudio, todos los métodos de investigación y los resultados en la Tabla complementaria 1 y en los Materiales complementarios.

Se aislaron células placentarias, se cultivaron, se transdujeron con un vector lentiviral que codifica mcoET3, un transgén de FVIII diseñado mediante bioingeniería, optimizado para codones mieloides humanos, que contiene elementos de alta expresión de FVIII12 porcino, y se analizaron para determinar la producción, fenotipo, viabilidad/función, estabilidad genómica y inmunogenicidad como se describió anteriormente11 y se detalla en la Tabla complementaria 1. El PLC-mcoET3 utilizado en este estudio cumplió con los criterios de tener un VCN <5 y producción de FVIII/10^6 células/24 h > 5 UI.

La sangre se recogió en tubos de citrato de sodio (BD Biosciences, 369714) y el plasma se aisló mediante centrifugación a 400 × g, 30 min y se almacenó a -80 °C hasta que se ejecutaron los ensayos de aPTT. Los ensayos de aPTT fueron realizados por el Laboratorio de Hematología Especial del Centro Médico Bautista Wake Forest utilizando procedimientos clínicos estándar. En resumen, el plasma de referencia estándar se produjo combinando plasma de un gran número (p. ej., 40) de voluntarios sanos normales y se le asignó un valor de niveles de FVIII del 100%. Luego se prepararon diluciones en serie de este plasma de referencia en plasma deficiente en FVIII para establecer una curva estándar con valores de 100, 50, 33, 25, 12,5, 10 y 1% de los niveles normales de FVIII. Este plasma de referencia humano normal, plasma de animales trasplantados y plasma combinado de 4 a 6 ovejas de control no trasplantadas para ser analizados se mezclaron con el plasma deficiente en FVIII y los estándares y muestras se procesaron en un coagulómetro clínico ACL Top 300 CTS. (Laboratorios de Instrumentación, 00000280060). Luego, los resultados se representaron en papel Log-Lin, representando las diluciones en el eje X logarítmico y los tiempos de coagulación en el eje Y lineal. Se trazó una línea vertical desde la dilución que produjo 100 UI/dl (100%). Donde esta línea interceptaba la línea de mejor ajuste para el estándar de plasma de referencia; se trazó una línea en ángulo recto hasta que interceptó la muestra de sobrenadante que se estaba analizando. Luego se dejó caer una línea vertical hasta que interceptó el eje X para establecer el nivel de FVIII en las ovejas normales y trasplantadas.

Todas las pruebas se realizaron sin conocer el estado del tratamiento de los animales. El aumento porcentual en la actividad del FVIII sobre un conjunto de ovejas de control normales se calculó utilizando la ecuación. (1).

Para confirmar la presencia de ET3 y hFVIII en el plasma de animales trasplantados, se realizó cromatografía líquida de digestión de proteínas-espectrometría de masas en tándem (LC-MS) de forma ciega como se detalla a continuación. Se aplicó el algoritmo de normalización DIA de andamio para la cuantificación de la intensidad para ajustar adecuadamente los valores con fines de comparación. Las intensidades sumadas de diferentes muestras de MS se transformaron primero en log10 y se construyó un histograma para cada muestra. Se calcularon los trimestres de cada muestra y se compararon con los trimestrales de todo el experimento. La intensidad exclusiva representa el valor de intensidad resumido de solo los péptidos asociados con esta proteína.

El contenido de proteínas de las muestras de plasma se estimó utilizando el ensayo de proteínas basado en fluorescencia EZQ (Invitrogen #R33200). Se redujeron 100 μg de extractos de proteínas, se alquilaron con yodoacetamida y se digirieron con una mezcla de tripsina/proteasa Lys-C utilizando el kit de preparación de muestras Thermo Scientific EasyPep Mini MS (n.º de catálogo A40006), siguiendo el protocolo proporcionado. Se añadió tripsina/Lys-C 1:10 (enzima: proteína) para la digestión. Las muestras se limpiaron para el análisis utilizando la columna proporcionada con el kit y se reconstituyeron en 100 µl de ácido fórmico al 0,1 % en agua, obteniendo una concentración final de 1 µg/ul para el análisis.

Las muestras se analizaron utilizando un sistema nano UltiMate 3000 RSLC (Thermo Scientific, San José, CA). Los péptidos se atraparon antes de la separación en una trampa C18 PepMap 100 de 300 μm de diámetro interno x 5 mm (Thermo Scientific, San José, CA) durante 5 minutos a 10 μl/min. La separación se realizó en una columna nano-LC uPAC C18 de 50 cm (PharmaFluidics, Gante, Bélgica) en una fuente EasySpray (Thermo Scientific, San José, CA) equipada con un emisor de acero inoxidable de 30 μm de diámetro interior (PepSep, Marslev, Dinamarca). La separación se realizó a 350 nl/min utilizando un gradiente de 1 a 45 % durante 60 min (disolvente A: 0,1 % de ácido fórmico; disolvente B: acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico).

El análisis independiente de datos (DIA) se realizó utilizando un espectrómetro de masas Eclipse Tribrid Orbitrap (Thermo Scientific, San José, CA)43,44 con una biblioteca cromatográfica como lo describen Searle et al.45. Brevemente, se utilizaron seis fracciones de fase gaseosa (GPF) del conjunto de muestras biológicas para generar una biblioteca de referencia. La adquisición de GPF utilizó ventanas de aislamiento de precursores de 4 m/z en un patrón escalonado (GPF1 398,4–502,5 m/z, GPF2 498,5–602,5 m/z, GPF3 598,5–702,6 m/z, GPF4 698,6–802,6 m/z, GPF5 798,6 –902,7 m/z, GPF6 898,7–1002,7 m/z) a una resolución de 60 000, el objetivo de AGC se configuró como personalizado con un objetivo normalizado del 1000 %, el tiempo máximo de inyección se configuró como dinámico con un mínimo de nueve puntos a lo largo del pico , y un NCE de 33 utilizando disociación por colisión de mayor energía (HCD). Las muestras biológicas se procesaron en un gradiente idéntico al de los GPF utilizando un esquema de ventana escalonada de 8 m/z en un rango de masas de 385 a 1015 m/z. El aislamiento de precursores se realizó en Orbitrap con una resolución de 60 000 con una inyección máxima dinámica que permite un mínimo de nueve puntos en todo el pico, un AGC personalizado normalizado al 1000 % y un NCE de 33 usando HCD. La base de datos FASTA específica de especie para Ovis aries (UP000002356) que contiene 23.111 proteínas se descargó de Uniprot. Se utilizó una biblioteca corregida empíricamente que combina GPF y la red neuronal profunda Prosit46 para generar fragmentos predichos y tiempos de retención. La secuencia ET3 se agregó a Ovis aries UP000002356 FASTA, se convirtió a un formato CSV compatible con Prosit y se envió a Prosit. El archivo Prosit convertido luego se convirtió al formato EncyclopeDIA DLIB. ScaffoldDIA (Proteome Software, Portland, OR) utilizando Ovis aries UP000002356 DLIB produjo una biblioteca corregida empíricamente utilizando las inyecciones de GPF-DIA. Las muestras de DIA-MS se analizaron utilizando Scaffold DIA (3.1.0). Los archivos de datos DIA-MS se convirtieron al formato mzML utilizando ProteoWizard (3.0.19254)47. Se realizó la deconvolución de ventanas al tresbolillo. Las muestras se alinearon según los tiempos de retención y se buscaron individualmente frente a Sheep_ET3.elib con una tolerancia de masa de péptidos de 10,0 ppm y una tolerancia de masa de fragmentos de 10,0 ppm. Las modificaciones variables consideradas fueron: Carbamidometilación C. La enzima de digestión fue tripsina con un máximo de 1 sitio de escisión omitido. Se consideraron péptidos con cargas de 2 a 3 y una longitud de 6 a 30 aminoácidos. Los péptidos identificados en cada muestra se filtraron con Percolator (3.01.nightly-13-655e4c7-dirty)48,49,50 para lograr un FDR máximo de 0,01. Se combinaron los resultados de búsqueda individuales y a las identificaciones de péptidos se les asignaron probabilidades de error posteriores y se filtraron a un umbral FDR de 0,01 mediante Percolator. La cuantificación de péptidos se realizó mediante Encyclopedia (1.2.2). Para cada péptido, se seleccionaron para la cuantificación los 5 iones fragmentados de mayor calidad. Las proteínas que contenían péptidos similares y que no podían diferenciarse según el análisis MS/MS se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia. Los grupos de proteínas se establecieron como umbral para lograr una FDR de proteína <1,0%.

Los ensayos ciegos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) fueron realizados por el Centro de Diagnóstico de Salud Animal de la Universidad de Cornell. Los valores normales de AST y ALT en ovejas son <280 y <50 U/L respectivamente. Se usó sangre completa para determinar WBC/mL usando el kit de prueba LeukoCheck (Biomedical Polymers 21243285). Los niveles de hematocrito fueron determinados por el personal veterinario.

Se recubrieron placas de alta unión (Corning, 9018) con proteína ET3 como se describió anteriormente51. Los plasmas de oveja se diluyeron en serie comenzando con una dilución 1:20 y se detectó la unión de anticuerpos con IgG anti-ovina:ALP (Bio-Rad STAR88A) o IgM anti-ovina:ALP (AbCam, AB112761) y p-nitrofenilfosfato ( Bio-Rad, 1721063). El título de anticuerpos se definió como la dilución de plasma con un valor de absorbancia> 2 DE por encima de la DO media del plasma de oveja de control (n = 4). Figuras complementarias 7a, b.

Para cuantificar los niveles de injerto de mcoET3-PLC en receptores de IUTx, se realizó RT-qPCR utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Flex de Applied Biosystems. Se recolectaron muestras de tejido de receptores de IUTx de hígado, pulmones, timo, bazo, cerebro, riñones, páncreas e intestino, y se conservaron en RNAlater (Qiagen, AM7020). El ARN se aisló y se convirtió en ADNc utilizando el kit Omniscript RT (Qiagen, 205113) según las instrucciones del fabricante. La RT-qPCR se realizó utilizando 10 ng de ADNc/muestra, la premezcla de qPCR TB Green Advantage (Takara Bio, 639676) y cebadores específicos para ovejas GAPDH (gen de mantenimiento) y mcoET3 (cebador Fwd: GCAGGGATGTCCCACCACATT; cebador Rev: GTATGGACAGTGGGCACCAA) en concentraciones finales de 200 nM y 350 nM, respectivamente. Los valores de Ct brutos obtenidos de las muestras de tejido se normalizaron utilizando el valor de Ct para el gen de mantenimiento para obtener ΔCt. El porcentaje de injerto se determinó comparando ΔCt con una curva estándar que consiste en porcentajes crecientes de mcoET3-PLC (0, 0,01, 0,1, 1, 5 y 10%) en células estromales de oveja (MSC).

Para cuantificar los niveles de mcoET3-PLC presentes en diferentes órganos, se realizó qPCR como se describió anteriormente52 utilizando el sistema de PCR QuantStudio 6 de Applied Biosystems. Se recogieron muestras de tejido de hígado, pulmón, bazo y timo, y se conservaron en Allprotect Tissue Reagent (Qiagen, n.º de catálogo 76405). El ADN se aisló utilizando el kit DNEasy Blood and Tissues (Qiagen, número de catálogo 69504), según las especificaciones del fabricante. La qPCR se realizó utilizando 100 ng de ADNg por muestra, con TaqMan Universal Master Mix (ThermoFisher, n.º de catálogo 4440043) y cebadores diseñados para el objetivo Human Alu (cebador directo: 5′-GGTGAAACCCCGTCTCTACT-3′) (cebador inverso: 5′ -GGTTCAAGCGATTCTCCTGC-3'), y una sonda de hidrólisis (5′-CGCCCGGCTAATTTTTGTAT-3') marcada con el indicador 6-FAM y el extintor BHQ1. La concentración de trabajo del cebador y la concentración de trabajo de la sonda de hidrólisis fueron 0,2 y 0,25 µM, respectivamente. Se preparó una curva estándar que consistía en ADN de oveja sin ADN humano, o ADN de oveja enriquecido con cantidades crecientes (0,25, 0,5, 1, 5 y 10 ng) de ADN humano derivado de PLC hasta un total de 100 ng de ADN por muestra. . Cada muestra se evaluó por triplicado bajo las siguientes condiciones de PCR; 1 ciclo de 95 °C por 10 min, seguido de 50 ciclos de 95 °C por 15 s, 56 °C por 30 s y 72 °C por 30 s. Se incluyó un control sin plantilla para cada ejecución.

El ARN extraído de (1) una alícuota de mcoET3-PLC que se trasplantó, (2) de los diferentes tejidos de ovejas que se trasplantaron en el útero y de (3) los mismos tejidos de ovejas de control no trasplantadas se cuantificó utilizando un NanoDrop. 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.), y la integridad del ARN se evaluó utilizando el ensayo Bioanalyzer RNA 6000 Nano y el 2100 Bioanalyzer (Agilent). Luego, todas las muestras de ARN se enviaron a Qiagen para la construcción de la biblioteca RNA-seq y a Illumina NGS. Se crearon bibliotecas completas de transcriptoma RNA-seq utilizando el kit HMR QIAseq UPXome RNA Lib (n.º de catálogo de Qiagen 334705) siguiendo el protocolo estándar del fabricante. En resumen, el ARN total se sometió a supresión de ARN ribosómico (ARNr) utilizando los kits de eliminación de ARNr QIAseq FastSelect HMR (n.º de catálogo de Qiagen 334386) y luego se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando hexámeros aleatorios y cebadores oligo-dT durante 90 minutos a 42 °C. Durante la síntesis de ADNc, cada muestra recibe una identificación de muestra única que permite la combinación de ADNc y todos los pasos posteriores de construcción de la biblioteca de muestras agrupadas se realizaron en un solo tubo para minimizar los efectos del lote. Después de la combinación de ADNc, se realizaron dos rondas de selección de perlas/limpieza de reacción con perlas QIAseq (n.º de catálogo de Qiagen 1107149). Luego, el ADNc se amplificó con índices de muestra únicos y duales utilizando el kit de índice QIAseq UX 12 IL UDI (n.º de catálogo de Qiagen 331801).

Luego, las bibliotecas completas se purificaron mediante dos rondas de limpieza basada en perlas con perlas QIAseq. La calidad de las bibliotecas finales se controló utilizando un bioanalizador Agilent y se cuantificaron mediante qPCR en tiempo real usando el kit de ensayo cuantitativo de biblioteca QIAseq (n.º de catálogo de Qiagen 333314) y se secuenciaron usando un Illumina Next-Seq 500 usando una secuenciación de extremos de pares de 75 bases usando NextSeq 500/550. Kit de salida media (150 ciclos).

Los archivos FASTQ se cargaron en el portal de análisis QIAGEN RNA-seq (https://geneglobe.qiagen.com/us/analyze/) y se alinearon con Homo sapiens (GRCh38.noalt.103) con la versión del flujo de trabajo de análisis: 1.0. (https://resources.qiagenbioinformatics.com/manuals/rnaanalysisportal/current/index.php?manual=QIAseq_UPXome_RNA_Lib_Kit.html).

Las bibliotecas de RNA-seq se alinearon con las bibliotecas de Homo sapiens después de eliminar cualquier posible reactividad cruzada con transcripciones ovinas. Luego comparamos las transcripciones del mcoET3-PLC transducido antes del trasplante, con transcripciones humanas que se sabe que se expresan en células específicas de diferentes órganos.

Para determinar la ubicación de mcoET3-PLC en los tejidos, se realizó tinción IHC en tejidos incluidos en parafina recolectados de los cuatro animales analizados al nacer. El hígado, el pulmón, el bazo y el timo se tiñeron utilizando un anticuerpo contra el antígeno nuclear específico humano, Ku80 (Cell Signaling Technologies, 2753S) y una IgG anti-conejo de cabra Alexa-Fluor 594 (Life Technologies, A11012). Para detectar FVIII/mcoET3 humano en un animal HA, se usó un anticuerpo primario dirigido al dominio C2 del FVIII humano (Sekisui Diagnostics, ESH-8) y se detectó con un anticuerpo secundario IgG AF-594 anti-ratón de cabra (Life Technologies, A11032). Los controles de tejido positivos (tejidos humanos) y los controles de tejido negativos (tejidos de oveja no IUTx) se tiñeron y evaluaron en paralelo con cada experimento realizado para evaluar portaobjetos de tejido experimentales. Las imágenes confocales se adquirieron con un microscopio confocal Olympus Fluoview FV1000 y un objetivo de aceite Olympus UPlanFLN-40x/1,30.

Para identificar PLC-mcoET3 en tejidos y visualizar simultáneamente la morfología del tejido, se utilizó IHC utilizando métodos de detección cromogénica y anticuerpos contra el antígeno nuclear específico humano, Ku80 (Cell Signaling Technologies, 2180), la enzima del ciclo de la urea humana CPS1 (HepPar1) (Thermo Fisher, número de catálogo). . MSM4-966-P1), LYVE1 antihumano (AbCam, n.º de catálogo ab219556) y albúmina antihumana (ThermoFisher, n.º de catálogo MA1-19174). Específicamente, después de la desparafinación y rehidratación del tejido, se realizó la recuperación del antígeno (tampón EDTA, pH 6,0) utilizando un procesador automatizado IHC. Los tejidos se bloquearon con una solución de bloqueo BLOXALL (Vector Laboratories, SP-6000) y un medio de bloqueo MAXBlock (Active Motif, 15252) según las instrucciones del fabricante. La tinción se realizó utilizando un anticuerpo Ku80 antihumano de conejo (Cell Signaling Technologies, 2180), diluido en solución de tinción MAXBind (Active Motif, 15253) y se incubó durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario era un anticuerpo IgG anti-conejo de pollo (Novus Biologicals, NBP1-75267), diluido en solución de tinción MAXBind y incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizó el reactivo VECTASTAIN Elite ABC (Vector Laboratories, PK-6100) según las instrucciones del fabricante, seguido de la incubación en reactivo ImmPACT DAB (Vector Laboratories, SK-4105) hasta que se desarrolló el color y se detuvo la reacción con agua desionizada. Los portaobjetos se lavaron con agua y se aplicó una contratinción con hematoxilina. Para identificar células positivas para LYVE-1 o enzima del ciclo de la urea CPS1, los portaobjetos de tejido se sometieron a recuperación de antígeno (tampón basado en Tris, pH 9,0) utilizando un procesador automatizado IHC y bloqueo utilizando la solución de bloqueo BLOXALL (Vector Laboratories, SP-6000) y bloqueo MAXBlock. Medio (Active Motif, 15252) según las especificaciones del fabricante. Los anticuerpos primarios utilizados fueron un LYVE1 antihumano de conejo (AbCam, ab219556), diluido 1:1000 en solución de tinción MAXBind (Active Motif, 15253) o un anticuerpo CPS1 antihumano de ratón (HepPar1) (Thermo Fisher, MSM4-966-P1 ), diluido en solución MAXBind-Staining (Active Motif, 15253). El primero se incubó durante la noche a 4 C y el segundo durante 1 hora a temperatura ambiente según las especificaciones del fabricante. Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con una enzima HRP (AbCam, ab214880) en una concentración prediluida y lista para usar, incubado durante 10 minutos a temperatura ambiente y anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con una enzima AP ( Laboratorios Vector, MP-7714). Después del lavado, se añadió el sustrato de peroxidasa ImmPACT DAB (Vector Laboratories, SK-4105) o el sustrato ImmPACT Vector Red (Vector Laboratories, MP-7714) y se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron inmediatamente con agua y luego se aplicó una contratinción con hematoxilina. Los portaobjetos de tejido se cubrieron con un cubreobjetos y se tomaron imágenes con un aumento de 20X utilizando un microscopio de campo claro LEICA DM4000B.

Para detectar simultáneamente albúmina humana y núcleos humanos, los portaobjetos de tejido se sometieron a una recuperación de antígeno (tampón a base de citrato, pH 6,0), seguido de una tinción IHC utilizando el kit de polímero de doble tinción ImPRESS® Duet (Vector Laboratories, MP-7714), que incluye el bloqueo mediante BLOXALL Solución bloqueadora y suero normal de caballo (2,5%) según especificaciones del fabricante. Los dos anticuerpos principales utilizados fueron un anticuerpo de ratón anti-albúmina humana (ThermoFisher, MA1-19174) y un anticuerpo de conejo anti-Ku80 humano (Cell Signaling Technology, 2753S), diluidos a 1:200 y 1:100, respectivamente, en MAXBind. -Solución de tinción (Active Motif, 15253) y se incuba durante la noche a 4 °C, según las especificaciones del fabricante. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con AP y un anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP (Vector Laboratories, MP-7714), como una solución lista para usar, incubada durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el sustrato ImmPACT DAB y se dejó desarrollar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron los portaobjetos, se añadió sustrato ImmPACT Vector Red y se dejó desarrollar durante 4 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se enjuagaron con agua y luego se aplicó una contratinción con hematoxilina.

Los controles de tejido positivos (tejidos humanos) y los controles de tejido negativos (tejidos de oveja no IUTx) se tiñeron y evaluaron en paralelo con cada experimento realizado para evaluar portaobjetos de tejido experimentales. Los detalles sobre los anticuerpos utilizados, las diluciones y los métodos de validación aparecen en la Tabla complementaria 7. Se tomaron imágenes de secciones de tejidos utilizando un microscopio de campo claro LEICA DM4000B (aumento de 20X) y las células positivas se identificaron/cuantificaron mediante la Imagen J.

Las respuestas de memoria reactiva Th1 y Th2 a ET3 se determinaron mediante ensayos ELISpot de IFN-γ (MabTech, 3119-4APW-2) e IL-4 (MabTech, 3118-2 A) como se describió anteriormente53,54. Se aislaron PBMC de sangre completa utilizando Histopaque 1077 (Sigma Aldrich, 1077), siguiendo las pautas del fabricante. Luego se cultivaron PBMC en una de tres condiciones: sin un antígeno estimulante (control sin estímulo), con ET3 o en presencia del mitógeno no específico fitohemaglutinina-L (PHA-L) (Sigma Aldrich, C11249738001) para realizar pruebas de anergia celular. Las concentraciones de trabajo de ET3 y PHA-L fueron de 10 μg/ml. Después de completar el cocultivo de 40 h, se lavó la placa y se agregaron IFN-γ e IL-4 anti-ovinos, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con ALP y las manchas se visualizaron mediante escisión enzimática del sustrato de ALP. Se definió una respuesta positiva cuando se cumplieron los dos criterios siguientes: (1) la relación entre el número de unidades formadoras de manchas (SFU) en presencia y ausencia de ET3 es > 2 (índice de estimulación > 2); y (2) se alcanzó un umbral mínimo de 10 SFU/2 × 105 PBMC.

Para determinar si los receptores de IUTx eran tolerantes al PLC del donante, probamos las respuestas proliferativas mediante la reacción de linfocitos mixtos (MLR) utilizando un ELISA de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Roche, 12352200). Una MLR proporciona un modelo in vitro eficiente y altamente específico para el estudio de la proliferación de células T en respuesta a un antígeno alogénico o xenogénico. Para estos ensayos, las células respondedoras fueron PBMC aisladas de receptores IUTx y animales de control no IUTx. Las células estimuladoras fueron: (1) PLC no transducidas del mismo donante; (2) PLC del mismo donante transducido con vector LV que codifica mcoET3; (3) PBMC xenogénicas (humanas de terceros) y (4) PHA-L como mitógeno estimulante. Las células respondedoras también se cultivaron solas para determinar los niveles iniciales de incorporación de BrdU durante el período de incubación. Después de sembrar placas de 96 pocillos con células estimuladoras de tipos 1 a 3 por triplicado, se indujo la detención del ciclo celular (solo en las células estimuladoras) añadiendo mitomicina C (Stem Cell Technologies, 73274). La concentración de mitomicina C necesaria para detener específicamente la división celular en PLC se derivó empíricamente, probando concentraciones de mitomicina C que oscilaban entre 0,5 y 50 ng/ml. Después de un lavado minucioso de las células estimuladoras, se agregaron PBMC respondedoras y se cultivaron conjuntamente en una proporción de 10:1 (Respondedor:Estimulador). El cocultivo de MLR se realizó durante 120 h en IMDM 10% FBS, luego las células se marcaron durante la noche con el análogo de timidina BrdU y se analizaron para determinar la absorbancia diferencial mediante ELISA según las pautas del fabricante. El índice de estimulación (SI) se calculó basándose en criterios SI típicos para cultivos MLR donde: SI = (Estimulador + Respondedor)/(Respondedor).

Para determinar si los receptores de IUTx desarrollaron una respuesta de anticuerpos dirigida a HLA debido a la exposición a PLC humano, se realizó un ensayo Luminex para la detección de anticuerpos IgG HLA Clase I y Clase II de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Immucor, 628200). Brevemente, se usaron placas de filtro multipantalla de 1,2 μm (Millipore Sigma, MSBVN1210) para incubar la mezcla de perlas HLA proporcionada por el fabricante junto con el suero de receptores IUTx en la proporción designada. Después de 30 minutos de incubación, los pocillos de la placa se lavaron tres veces (tampón de lavado: tampón a base de fosfato con NaCl, Tween-20, NaN3 y BSA). Luego, se añadió un conjugado de anticuerpo IgG-ficoeritrina de oveja (R&D Systems, F0126) en tampón de lavado para una incubación adicional durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió el volumen prescrito de tampón de lavado, se mezcló para resuspender las perlas, se determinó la fluorescencia de la muestra con un fluoroanalizador Luminex 200 y se realizó el análisis utilizando el software de anticuerpos Luminex. El valor medio de la intensidad de fluorescencia (MFI) de cada perla se comparó con tres valores de corte para establecer factores de ajuste de fondo (BAF). Los valores de corte se calcularon a partir del fondo determinado de tres perlas de control negativo en cada pocillo de prueba. Esto se repitió para cada una de las dos cuentas para obtener tres resultados o valores de MFI ajustado (AMFI). Una muestra se consideró positiva si dos o más valores de AMFI eran positivos. Una muestra se consideró negativa si dos o más valores de AMFI eran negativos.

Un patólogo veterinario especializado realizó un examen anatómico macroscópico para determinar la presencia de anomalías morfológicas relacionadas con la terapia y evaluó portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) de hígado, pulmones, bazo, timo, intestino y cerebro para identificar posibles alteraciones histopatológicas.

Anteriormente hemos descrito el establecimiento de una línea de ovejas HA que albergan un codón de parada prematuro y una mutación de cambio de marco en el exón 14 del gen FVIII. Clínicamente, estos animales imitan estrechamente la HA humana grave, exhibiendo constantemente un fenotipo de hemorragia grave, con hemartrosis espontánea, que conduce a una locomoción reducida, hematomas musculares y episodios de hematuria. Además, si estas ovejas HA no reciben tratamiento poco después del nacimiento, los animales morirán por hemorragia interna o del cordón umbilical. Para generar animales HA, se criaron portadores de HA mediante reproducción natural o mediante clonación mediante transferencia nuclear de células somáticas.

Todos los datos mostrados, a menos que se especifique lo contrario, se presentan como media +/− error estándar de la media (SEM). Se utilizó el software GraphPad PRISM v8 para realizar todos los análisis estadísticos. Las comparaciones entre los resultados experimentales se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas, para comparaciones simples, o mediante ANOVA unidireccional seguido de un análisis post hoc utilizando el método de Tukey para datos que involucran comparaciones múltiples, para determinar los valores de p individuales. El valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

La detección de marcadores celulares específicos y la cuantificación de células positivas para Ku80 humano (antígeno nuclear) en el hígado de animales IUTx mediante inmunohistoquímica mediante detección cromogénica se realizaron en portaobjetos de todos los animales y de controles positivos (humanos) y negativos (ovejas no tratadas). en al menos tres experimentos diferentes. En cada portaobjetos, la cuantificación se realizó en tres regiones de interés (ROI). Para eliminar el sesgo del observador, se utilizó un script ImageJ para procesar el ROI (ROI) e identificar células positivas. El script desconvolucionó cada imagen de ROI en una imagen H&E y una imagen DAB, luego consideró las celdas positivas usando umbrales de tamaño, circularidad y color. En detalle, se crearon macros específicas con múltiples funciones para automatizar una serie de tareas que incluían normalización, procesamiento y análisis de una gran cantidad de imágenes. El paso de normalización utilizó técnicas como la deconvolución de color, que separa los canales de imagen en hasta 3 colores específicos. También se utilizaron tareas como la nitidez y la nivelación del contraste para ganar intuición para el análisis posterior. También se aplicó una función de "restar fondo" para aislar y analizar características en una imagen sobre una intensidad de fondo uniforme, así como la función "después" con algoritmos de umbral automático, para segmentar la imagen en diferentes regiones según los valores de intensidad de píxeles. La función "cuenca de aguas" se utilizó para separar objetos que se tocan o se superponen en la imagen. Después de normalizar cada imagen, se utilizó la función "analizar partículas" para identificar y medir características en la imagen, con opciones de rango de tamaño, forma e identidad elegidas en función de la visualización de la señal positiva. En algunos casos, fue necesario ajustar aún más los parámetros de análisis para obtener resultados precisos, lo que se hizo “entrenando” cada conjunto de datos. La macro se ejecutó varias veces, ajustando los parámetros según fuera necesario para mejorar su rendimiento general. Desafortunadamente, no había datos reales disponibles, por lo que los parámetros se ajustaron manualmente después de una inspección visual de los resultados de la macro para garantizar la precisión.

La detección de células positivas para Ku80 humano (antígeno nuclear) y FVIII mediante inmunohistoquímica utilizando inmunofluorescencia se realizó en animales IUTx y en controles positivos (humanos) y negativos (ovejas no tratadas) en al menos tres experimentos diferentes. La cuantificación se realizó utilizando tres portaobjetos diferentes y contando un total de 1000 a 1500 células.

Para el análisis histopatológico (Fig. 8), siempre que la cantidad de tejido recolectado lo permitiera, el patólogo envió de 2 a 4 secciones de tejido por órgano y las analizó.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos principales que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y en la información complementaria y los archivos de datos complementarios. Los datos originales se proporcionan con este documento. Los datos de secuenciación de próxima generación generados en este estudio se depositaron en GEO con el número de acceso GSE230081. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi Los datos fuente se proporcionan con este documento.

Los scripts personalizados para la cuantificación de células positivas utilizando ImageJ están disponibles en GitHub: https://github.com/jhd8593/Martin_IHC.git

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Este trabajo fue apoyado por NIH, NHLBI, HL135853, HL148681 MR y GDA son los beneficiarios de una subvención de becas de posgrado del HHMI Gilliam. BT cuenta con el apoyo de un puesto de becario predoctoral T32 NIH NIBIB 2T32EB014836-06A. El doctorado de Mick Hitchcock. El Centro de Proteómica de Nevada cuenta con el respaldo de NIH, NIGMS, GM103440. Nos gustaría agradecer al Laboratorio Especial de Hematología de Wake Forest Baptist Health por su excelente soporte técnico y el desempeño de las pruebas de FVIII, al Centro de Fabricación de Núcleos Traslacionales del Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa por proporcionar el PLC utilizado en estos estudios, a Wake Forest ARP por el laboratorio clínico cuidado de los animales, y Rebecca Woolsey de The Mick Hitchcock Ph.D. Centro de Proteómica de Nevada. Nos gustaría agradecer al Dr. Samuel Rulli y al Dr. Martin Kreutz de Qiagen por su ayuda con el diseño experimental de evaluación de la diferenciación celular, por realizar la construcción de la biblioteca RNA-seq, NGS y análisis de datos.

Estos autores contribuyeron igualmente: Christopher D. Porada, Graça Almeida-Porada.

Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa, Programa de Terapia e Investigación Fetal, Facultad de Medicina Wake Forest (WFSOM), Winston Salem, Carolina del Norte, EE. UU.

Martin Rodriguez, Brady Trevisan, Ritu M. Ramamurthy, Sunil K. George, Jonathan Diaz, Anthony Atala, Christopher D. Porada & Graça Almeida-Porada

Centro Aflac de Cáncer y Trastornos Sanguíneos, Children's Healthcare of Atlanta y Departamento de Pediatría, Emory University, Atlanta, GA, EE. UU.

Jordan Alexander, Christopher B. Doering y H. Trent Spencer

Laboratorio Especial de Hematología, Facultad de Medicina Wake Forest, Winston Salem, Carolina del Norte, EE. UU.

Diane Meares y Andrew Farland

Desarrollo preclínico, Wave Life Sciences, Lexington, MA, EE. UU.

Denise Schwahn

El doctorado de Mick Hitchcock. Centro de Proteómica de Nevada, Universidad de Nevada Reno, Reno, NV, EE. UU.

David R. Quilici

Centro de Investigación en Obstetricia y Ginecología, WFSOM, Winston Salem, Carolina del Norte, EE. UU.

Jorge Figueroa

HLA/Laboratorios de Inmunogenética e Inmunodiagnóstico, Winston Salem, Carolina del Norte, EE. UU.

Michael Gautreaux

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MR, BT, RR y SKG ejecutaron experimentos, análisis e interpretación de datos; JD, DM, DRQ, AF, MG, JF y DS aportaron conocimientos técnicos; JA proporcionó reactivos; CBD, HTS y AA proporcionaron reactivos y retroalimentación experimental; Manuscrito redactado por RM; Concepción y diseño experimental de GAP y CDP, experimentos supervisados, análisis e interpretación de datos realizados, redacción de la versión final del manuscrito y financiación asegurada.

Correspondencia a Graça Almeida-Porada.

CBD y HTS son cofundadores de Expression Therapeutics, Inc. y poseen capital en la empresa. El Dr. Denning es empleado de Expression Therapeutics, Inc. Expression Therapeutics obtuvo la licencia de la propiedad intelectual asociada con el transgén ET3 con codones optimizados y el promotor HCB. Los términos de este acuerdo han sido revisados ​​y aprobados por la Universidad Emory de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. El resto de los coautores no tienen intereses financieros y no financieros en competencia.

Nature Communications agradece a Diana Lee Farmer, Alan Flake y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Rodríguez, M., Trevisan, B., Ramamurthy, RM et al. El trasplante de células secretoras de FVIII/ET3 en fetos de oveja aumenta los niveles de FVIII a largo plazo sin inducir inmunidad o toxicidad. Nat Comuna 14, 4206 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39986-1

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Recibido: 19 de abril de 2022

Aceptado: 26 de junio de 2023

Publicado: 14 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39986-1

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