Bacteroides ovatus acelera la metformina

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, número de artículo: 51 (2023) Citar este artículo

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La deficiencia de vitamina B12 (VB12), que puede provocar síntomas hematológicos y neurológicos, se ha asociado con el uso de metformina, pero el mecanismo subyacente no está claro. Aquí informamos que B. ovatus es un receptor eficaz de VB12 que se enriqueció en pacientes con diabetes tipo 2 que padecían deficiencia de VB12 después de 3 a 6 meses de tratamiento con metformina. La colonización de B. ovatus aumentó los niveles plasmáticos de ácido metilmalónico y homocisteína en ratones alimentados con una dieta alta en grasas (HFD) tratados con metformina y comprometió la eficacia de la metformina contra los trastornos metabólicos inducidos por HFD. Mecánicamente, la metformina aumentó la acumulación intracelular de VB12 en B. ovatus a través de la regulación positiva de btuB y promovió la producción de ATP para la translocación dependiente de energía de los transportadores de VB12 en la membrana interna, lo que llevó a una mayor colonización de B. ovatus para competir por VB12 con los huéspedes y posteriormente una deficiencia agravada de VB12 en el huésped. Nuestros hallazgos ilustran un mecanismo previamente no apreciado por el cual la metformina conduce a la deficiencia de VB12 del huésped al actuar directamente sobre las bacterias intestinales para aumentar su absorción y consumo de VB12, y sugieren que la competencia entre microbios entre huéspedes por nutrientes puede afectar ampliamente la salud humana y la seguridad de los medicamentos.

La metformina es el tratamiento hipoglucemiante de primera línea para pacientes con diabetes tipo 2 y está reconocida por todas las directrices1. El principal efecto secundario que figura en el prospecto es una mayor incidencia de deficiencia de vitamina B12 (VB12) (entre 5,8% y 33%)2, que se asocia positivamente con la dosis y la duración del tratamiento con metformina.

VB12 (cobalamina), que se obtiene de alimentos de origen animal, sirve como cofactor esencial en la síntesis de ADN y en el metabolismo de ácidos grasos y aminoácidos. Las manifestaciones clínicas de la deficiencia de VB12 incluyen anemia, neuropatía periférica, deterioro cognitivo y depresión2,3. En particular, la neuropatía periférica diabética (NPD), que causa daño a los nervios fuera del cerebro y la médula espinal y aumenta el riesgo de desarrollar pie de Charcot, es una de las complicaciones más comunes y graves de la diabetes4. Sin embargo, la deficiencia de VB12 asociada a metformina normalmente se ignora como una etiología importante de la neuropatía. Además, antes de una anemia franca pueden aparecer palidez y síntomas mentales, como fatiga y pérdida de memoria. Por lo tanto, en pacientes diabéticos, la deficiencia de VB12 suele subdiagnosticarse hasta que se presentan problemas clínicos más graves (p. ej., neuropatía irreversible y demencia), especialmente en personas de edad avanzada5. Un estudio a gran escala (n = 1975) demostró que, en comparación con los pacientes con diabetes tipo 2 que recibían otros antidiabéticos, aquellos que recibían tratamiento con metformina tenían una mayor prevalencia de NPD, lo que se asociaba significativamente con mayores dosis acumuladas y una mayor duración del tratamiento con metformina. , lo que indica que se debe prestar más atención a la seguridad del tratamiento a largo plazo con metformina6. Sin embargo, la deficiencia de VB12 asociada a metformina no ha sido bien reconocida en los últimos años y aún se desconoce la causa exacta. Por lo tanto, comprender la relación entre el uso de metformina y el estado de VB12 es clínicamente significativo y podría mejorar la eficacia de la metformina y ayudar a prevenir sus efectos secundarios en pacientes con diabetes tipo 2.

Se ha sugerido que la metformina inhibe la unión dependiente de Ca2+ del complejo VB12-factor intrínseco (IF), lo que altera la absorción de VB12 en el íleon terminal7,8. Sin embargo, aún se desconoce por qué la deficiencia de VB12 asociada a metformina se caracteriza por una alta heterogeneidad, según un informe de un metanálisis previo2. Además, aunque una mayor ingesta de calcio podría ayudar a revertir la reducción de holotranscobalamina inducida por la metformina, el nivel sérico total de VB12 no aumentó de manera efectiva después de un mes de suplementación con carbonato de calcio8. En conjunto, esto muestra que el mecanismo por el cual la metformina reduce las concentraciones séricas de VB12 aún no está claro.

Se ha informado que solo el 20% de las especies de bacterias y arqueas, como Propionibacterium UF19, son capaces de sintetizar cobalamina mediante vías de biosíntesis completas y de novo10, lo que da como resultado una red de interacciones microbianas relacionadas con el intercambio de cobamida que van desde la alimentación cruzada hasta la competencia11. 12. Debido a la prevalencia de la auxotrofia, los microbios deben depender de miembros productores de VB12 para mantener su función. Por lo tanto, lo que representa un arma de doble filo, los microbios intestinales no sólo proporcionan VB12 a los humanos huéspedes a través de la fermentación de carbohidratos complejos, sino que también compiten con los humanos por VB12. Un número excesivo de bacterias que colonicen el intestino delgado podría inducir el sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO), que se asocia con el riesgo de diabetes tipo 213 debido al tránsito lento del intestino delgado y al mayor consumo de vitaminas y nutrientes que necesita el ser humano. Sin embargo, pocos estudios han evaluado una relación específica entre los microbios intestinales y la deficiencia de VB12 inducida por metformina.

Por lo tanto, el objetivo principal del presente estudio fue investigar las asociaciones entre la microbiota intestinal y el estado de VB12 en pacientes con diabetes que toman metformina. Nuestra hipótesis es que algunas cepas especiales podrían secuestrar VB12 del tracto gastrointestinal con la ayuda de metformina. Dado que analizamos los cambios en las cadenas de transporte de electrones bacterianas bajo metformina, el objetivo secundario de nuestro estudio fue explorar el mecanismo potencial mediante el cual el fármaco antidiabético metformina actúa sobre las bacterias directamente para modular el perfil de la microbiota intestinal. Informamos que la abundancia relativa de Bacteroides ovatus en el intestino se asoció con la deficiencia de vitamina B12 inducida por metformina con datos de una cohorte prospectiva de pacientes que incluía sujetos con diabetes tipo 2 recién diagnosticada tratados con metformina durante 3 a 6 meses. Descubrimos que el tratamiento con metformina reguló positivamente la expresión del gen microbiano btuB y reguló la producción de trifosfato de adenosina (ATP) en B. ovatus, lo que fortaleció su capacidad para capturar VB12 y posteriormente redujo los niveles séricos de VB12 en el huésped.

Se informó que hubo una reducción estadísticamente significativa en los niveles de VB12 después de un período de 6 semanas de tratamiento con metformina14. En este documento, diseñamos un ensayo clínico prospectivo que incluyó de 12 a 24 semanas de tratamiento con metformina en pacientes con diabetes tipo 2 recién diagnosticada. De acuerdo con criterios bien establecidos15, evaluamos el estado de VB12 y las manifestaciones clínicas de la deficiencia de VB12 en 26 pacientes que se dividieron en VB12 deficiente (n = 13, VB12 total en suero < 200 pg/mL) y no deficiente (n = 13, suero total VB12 > 200 pg/mL) grupos. Sus características clínicas se muestran en la Tabla complementaria 1. Los pacientes con deficiencia tenían un nivel significativamente más bajo de VB12 total en suero y un nivel más alto de homocisteína en comparación con los pacientes sin deficiencia, pero no hubo diferencias significativas en su folato y hemoglobina (Fig. 1a- d).

a Niveles séricos totales de VB12 de pacientes con diabetes tipo 2 después del tratamiento con metformina durante 12 a 24 semanas. b Los niveles de homocisteína de pacientes con diabetes tipo 2 después del tratamiento con metformina. c Los niveles de folato de pacientes con diabetes tipo 2 después del tratamiento con metformina. d Los niveles de hemoglobina de pacientes con diabetes tipo 2 después del tratamiento con metformina. e Gráficos de barras apiladas que muestran las abundancias relativas porcentuales promedio a nivel de género para los grupos con deficiencia y sin deficiencia, respectivamente. Los taxones más abundantes se muestran como barras de diferentes colores, con los taxones de menor abundancia agrupados como una barra gris (Otros). f Las diferencias en la taxonomía bacteriana se clasificaron según el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LDA) entre los grupos con y sin deficiencia. g Correlación de Spearman entre la abundancia bacteriana y los biomarcadores del estado de VB12. h Abundancia de B. ovatus, P. vulgatus y B. uniformis basada en datos metagenómicos. La significación estadística se basa en los valores P y q obtenidos del análisis MaAsLin2. i Gráfico de volcán de las pruebas de abundancia diferencial de ALDEx2 en especies en la microbiota fecal de sujetos con y sin deficiencia, con especies significativamente diferentes resaltadas (FDR <0,05). j Importancia variable en la proyección (VIP) del clasificador forestal aleatorio que se desarrolló utilizando datos relacionados con la taxonomía. k PCoA de abundancias de ortólogos (KO) de KEGG; El grupo con deficiencia se muestra en azul y el grupo sin deficiencia se muestra en rojo; Se utilizó la prueba PERMANOVA con la distancia de Bray-Curtis para evaluar la diferencia significativa entre los dos grupos, y el resultado mostró una separación significativa de los grupos con deficiencia y sin deficiencia (P = 0,002). l Gráfico de volcán de datos de secuenciación metagenómica basado en el ortólogo KEGG (KO) en los grupos con y sin deficiencia. Valor de p determinado mediante la prueba t de Student de dos colas no pareada (b, d) y la prueba U de Mann-Whitney (a, c, g). Todos los datos se presentan como media ± SEM o media ± DE.

Para investigar si la microbiota intestinal era diferente entre los grupos deficientes y no deficientes, primero realizamos una secuenciación escopeta de todo el genoma para explorar la identificación taxonómica del microbioma a través de MetaPhlAn 4.0.6. El análisis de coordenadas principales (PCoA) reveló que el perfil de la microbiota intestinal presentó una clara alteración entre los dos grupos (Figura complementaria 1a). En pacientes con deficiencia de VB12, la abundancia relativa de Bacteroidetes estaba regulada al alza, mientras que la abundancia relativa de Firmicutes estaba regulada a la baja a nivel del filo. A nivel de género, las abundancias relativas de Megamonas spp., Bifidobacterium spp. y Blautia spp. disminuyeron, mientras que las abundancias de Bacteroides spp., Phocaeicoia spp. y Roseburia spp. se mejoraron (Figuras complementarias 1b, c). De acuerdo con el nivel de especie (Fig. 1e), el análisis con el método de tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LDA) (LEfSe) reveló que el grupo de deficiencia se caracterizó por B. ovatus, B. uniformis y Phocaeicola vulgatus (Fig. 1f). . Y la riqueza de B. ovatus y P. vulgatus se correlacionó negativamente con el nivel de VB12 (Fig. 1g). Los análisis diferenciales se realizaron mediante la prueba de suma de rangos de MaAsLin2, ALDEx2 y Wilcoxon con ajuste por covariables. Descubrimos que B. ovatus presentó una abundancia significativamente mayor en el grupo de deficiencia (Fig. 1h, i; Fig. complementaria 1d). A continuación, utilizamos un clasificador de bosque aleatorio para seleccionar las características discriminatorias en la microbiota intestinal para diferenciar especies incluidas B. ovatus y P. vulgatus (Fig. 1j).

Los perfiles de genes funcionales de la microbiota intestinal a nivel de KO también fueron diferentes entre los dos grupos (Fig. 1k). Los transportadores dependientes de TonB (TBDT) en la membrana externa (OM) de las bacterias gramnegativas se unen y transportan la VB12 ambiental a través de la OM hacia el espacio periplásmico16,17. El gen TonB, que codifica la proteína TonB, se enriqueció en el grupo deficiente. Por el contrario, la expresión de mtsA, mtsB y mtsC, que codifican proteínas de unión al sustrato del sistema de transporte de hierro / zinc / manganeso / cobre, fue relativamente baja en el grupo deficiente (Fig. 1l). Bacteroides spp. biosíntesis de enzimas dependientes de B12. Se informó que P. vulgatus podría codificar genes biosintéticos VB12 (como CbiA, CbiC)18, pero no B. ovatus, que debe capturar VB12 del tracto digestivo19. Estos resultados sugieren que la capacidad de absorción de VB12 por parte de ciertos microbios intestinales, como B. ovatus enriquecido, podría aumentar con el tratamiento con metformina.

Estudiamos el efecto del tratamiento con metformina sobre la acumulación de VB12 en B. ovatus. La concentración de VB12 en el sedimento bacteriano se determinó mediante LC‒MS/MS (Figuras complementarias 2a-e). El conocimiento actual sobre los TBDT en bacterias es limitado, excepto en Escherichia coli20. Como control, utilizamos E. coli K12, que parece absorber un alto nivel de VB12 del medio de crecimiento. Si bien no se encontraron cambios significativos en las curvas de crecimiento de E. coli tratadas con un rango de concentraciones de metformina (Fig. 2a), el tratamiento con metformina promovió de manera dependiente de la dosis el crecimiento de B. ovatus en la fase estacionaria al promover su adaptabilidad (Fig. 2b). Luego examinamos el efecto del tratamiento con metformina sobre la concentración intracelular de VB12 para las dos cepas que crecen en medios mínimos suplementados con cianocobalamina. Elegimos una concentración de 3,7 nM para cianocobalamina19 porque no puede reprimir los elementos de ARN asociados con los riboswitches B12 que pueden cambiar la conformación tras la unión específica a VB12. En particular, la metformina aumentó significativamente la acumulación intracelular de VB12 tanto en E. coli como en B. ovatus (Fig. 2c, d).

a, b Curvas de crecimiento de E. coli o B. ovatus con metformina a diferentes concentraciones (3 réplicas técnicas de 6 réplicas biológicas para cada grupo). c, d concentraciones de VB12 dentro de E. coli o B. ovatus con metformina en diferentes concentraciones (n = 9). e – g Abundancia relativa de ARNm de TonB, metH y scpA en E. coli tratada con metformina durante 1 h (n = 5). h – j Abundancia relativa de ARNm de btuB, metH y scpA en B. ovatus tratada con metformina durante 7 h (n = 5). Valor de p determinado mediante la prueba de Kruskal-Wallis (b, e–h, i) y el ANOVA unidireccional con las pruebas de Tukey o Dunnett (c, d, f, g, j). Todos los datos se presentan como media ± SEM o media ± DE.

Los TBDT constan de TonB, ExbB y ExbD, que son energizados por el gradiente electroquímico17. Los loci de transporte de corrinoides tanto en E. coli como en Bacteroides spp. tienen un transportador OM (BtuB) para capturar VB12 ambiental, y luego una proteína de unión periplásmica (BtuF) y transportadores dependientes de ATP de membrana interna (IM) (BtuC y BtuD) para transferir VB12 desde el periplasma al citoplasma21. De acuerdo con su efecto sobre las concentraciones intracelulares de VB12, la metformina (1,5 mM) aumentó significativamente la expresión de TonB en E. coli in vitro (Fig. 2e), pero no se encontraron cambios significativos en la expresión de genes que codifican otros TBDT o proteínas de unión ( Figura complementaria 3a). El nivel de ARNm de btuB en B. ovatus fue mucho mayor después de la incubación con metformina durante 7 h (40 μM, 1,5 mM) (Fig. 2h). Debido al control traduccional riboswitch de la expresión de btuB en el extremo 5 '16, planteamos la hipótesis de que la expresión de btuB podría eventualmente inhibirse después de la acumulación intracelular gradual de VB12. De acuerdo con esta hipótesis, encontramos que la expresión de btuB pareció aumentar de manera dependiente de la dosis a las 12 h (Figura complementaria 3b), seguida de una disminución abrupta a las 24 h después del tratamiento con metformina (Figura complementaria 3e).

La vitamina B12 (cobalamina) sirve como cofactor tanto para metH como para scpA, que catalizan la formación de metionina mediante la transferencia de un grupo metilo del 5-metil-tetrahidrofolato a homocisteína y la isomerización de metilmalonil-CoA a succinil-CoA, respectivamente. Para probar si VB12 fue transportado a través de OM e IM hacia el citoplasma, elegimos la expresión de metH y scpA como biosensores para representar el nivel intracelular de VB1217 disponible. Curiosamente, los niveles de ARNm de metH y scpA en B. ovatus fueron consistentes con los de btuB (Fig. 2i, j, Fig. Suplementaria 3c, d, Fig. Suplementaria 3f, g), lo que implicó que el tratamiento con metformina aumentó la capacidad de B. ovatus para competir por VB12. Sin embargo, solo se encontraron cambios de expresión moderados en metH y scpA en E. coli tratada con metformina 40 μM, pero no en aquellas tratadas con 1,5 mM (Fig. 2f, g). Estos datos indicaron que la metformina podría mejorar la absorción microbiana de VB12. Sin embargo, no todos los VB12 pueden ser utilizados eficazmente por diferentes bacterias.

Realizamos una secuenciación de ARN bacteriano para identificar los procesos biológicos que se vieron afectados por el tratamiento con metformina. El gráfico del volcán resalta los genes expresados ​​diferencialmente de E. coli (49 genes estaban regulados positivamente; 48 genes estaban regulados negativamente) y B. ovatus (46 genes estaban regulados positivamente; 34 genes estaban regulados negativamente) después del tratamiento con metformina (Fig. 3a, b).

Un gráfico de volcán que muestra la expresión diferencial de los 97 genes de E. coli tratados con metformina (a 1,5 mM) en comparación con el control. Los puntos azules representan genes significativamente regulados negativamente y los puntos rojos representan genes regulados positivamente (n = 3). b Gráfico de volcán que muestra la expresión diferencial de los 80 genes de B. ovatus tratados con metformina 1,5 mM en comparación con el control. Los puntos azules representan genes significativamente regulados negativamente y los puntos rojos representan genes regulados positivamente (n = 3). c Abundancia relativa de ARNm de fdnH en E. coli tratada con metformina durante 1 h (n = 3). d Las concentraciones de ATP en E. coli tratada con metformina durante 1 h (n = 5). e El potencial de membrana de E. coli tratada con metformina durante 1 h (n = 5). f La relación NADH/NAD+ de E. coli tratada con metformina y/o aceptor de electrones terminal (DMSO, NaNO2 y TMAO) durante 1 h (n = 3). g Expresión relativa de ARNm de enzimas codificantes implicadas en los genes de la ATP sintasa en B. ovatus tratada con metformina durante 7 h (n = 3). h Las concentraciones de ATP en B. ovatus tratadas con metformina durante 7 h (n = 3). i Las concentraciones de ATP en B. ovatus tratadas con metformina 1,5 mM durante 7 h y oligomicina A 2 μM durante 1 h (n = 3-5). j El potencial de membrana de B. ovatus tratado con metformina durante 7 h (n = 5). k La relación NADH/NAD+ de B. ovatus tratada con metformina 10 mM durante 7 h (n = 6). Valor de p determinado por el ANOVA unidireccional con las pruebas de Tukey o Dunnett (c, d, f–h), la prueba de Kruskal-Wallis (i) y la prueba U de Mann-Whitney (e, j, b). Todos los datos se presentan como media ± SEM o media ± DE.

El gen fdnH de E. coli, que codifica una subunidad de formiato deshidrogenasa que participa en la respiración anaeróbica de nitrato dependiente de NAD, se reguló negativamente (Fig. 3c). A través del análisis de la vía, los datos de secuenciación indicaron que el tratamiento con metformina condujo a una disminución de la actividad del transportador transmembrana/funciones GO de unión de vitaminas y a una regulación negativa de la vía KEGG del metabolismo del selenocompuesto, lo que sugiere que la función de la ATPasa y la vía biosintética de la metionina se alteraron con el tratamiento con metformina (Figura complementaria 4a). , b). A diferencia de los TBDT, que son impulsados ​​por una fuerza motriz de protones, la proteína IM BtuCD es un transportador de casete de unión a ATP (ABC) que bombea compuestos a través de la bicapa de fosfolípidos y se activa mediante la hidrólisis de ATP22. La metformina puede inhibir el complejo respiratorio I para disminuir la síntesis de ATP en los mamíferos. Por lo tanto, para probar si la metformina también alteraría las cadenas bacterianas de transporte de electrones en la síntesis de ATP, detectamos la producción de ATP intracelular. Como se esperaba, se descubrió que el tratamiento con metformina (1,5 mM y 10 mM) reducía los niveles de ATP en E. coli (Fig. 3d). Los complejos de cadenas respiratorias (complejos I, III y IV) son bombas de protones que mantienen el gradiente electroquímico de protones, que es aprovechado por la ATP sintasa para producir ATP a partir de ADP en la generación de energía celular23. Consistentemente, el tratamiento con metformina suprimió el potencial de membrana de E. coli, según lo determinado a partir del ensayo de potencial de membrana bacteriana (Fig. 3e). El complejo bacteriano I juega un papel importante en el mantenimiento del potencial electroquímico de los protones, en el que el NADH se oxida a NAD+ junto con la disociación de H+ para crear la fuerza motriz del protón24. Encontramos que la relación NADH/NAD+ fue significativamente mayor en E. coli después del tratamiento con metformina 1,5 mM, lo que podría contribuir al gradiente de membrana comprometido (Fig. 3f). Un electrón de alta energía pasa a lo largo de una cadena de transporte de electrones hasta los aceptores de electrones. La respiración anaeróbica de E. coli puede utilizar dimetilsulfóxido (DMSO), N-óxido de trimetilamina (TMAO) y nitrato como aceptores terminales de electrones25. Como se muestra en la figura 3f, la relación elevada NADH/NAD+ inducida por el tratamiento con metformina se eliminó durante el crecimiento anaeróbico con la adición de estos aceptores de electrones terminales.

Por el contrario, los datos de secuenciación indicaron que el tratamiento con metformina condujo a un aumento de las funciones GO de unión al hierro férrico y a una regulación positiva de la vía ribosomal KEGG, lo que sugiere que el transporte de iones metálicos y el crecimiento bacteriano se promovieron con el tratamiento con metformina en B. ovatus (Figura complementaria 4c, d ). Además, encontramos que la expresión no solo de atpC sino también de otros genes que codifican ATP sintasas (p. Ej., AtpD y atpE) aumentó con el tratamiento con metformina en B. ovatus (Fig. 3g). Además, como se esperaba, el tratamiento con metformina aumentó el nivel intracelular de ATP en B. ovatus (Fig. 3h). La oligomicina A, como inhibidor de las ATP sintasas, redujo en gran medida el nivel de ATP, lo que podría revertirse ligeramente con metformina (1,5 mM) (Fig. 3i). Para el complejo I, solo una alta concentración de metformina (10 mM) podría aumentar el potencial de membrana y disminuir la relación NADH/NAD+ (Fig. 3j, k), lo que indica que el tratamiento con metformina mejoró la producción de ATP en B. ovatus principalmente a través de su efecto sobre complejo V, en lugar del complejo I, en la cadena respiratoria.

En conjunto, estos datos sugieren que la metformina podría alterar la cadena bacteriana de transporte de electrones a través del complejo I o V para influir en la síntesis de ATP.

Para validar aún más la influencia de la abundancia de B. ovatus sobre el efecto del tratamiento con metformina en la disposición de VB12, diseñamos estudios en animales in vivo (Fig. 4a). Se realizó la colonización de B. ovatus en ratones con microbiota empobrecida. Después del tratamiento con antibióticos seguido de un trasplante de B. ovatus durante diez semanas en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, la abundancia de B. ovatus aumentó significativamente tanto en el colon (Fig. 4b) como en el intestino delgado (Fig. 4c). A través de la complejación con un IF, VB12 puede internalizarse en la célula ileal donde el complejo se degrada dentro de los lisosomas para liberar VB12 y luego VB12 se exporta a la circulación portal15. Y BtuG, una proteína en la superficie de Bacteroides, podría eliminar VB12 de los IF con alta afinidad y acoplarse con btuFCD para la absorción de VB1219. Por lo tanto, al colonizar el intestino delgado, se esperaría que B. ovatus compitiera con el huésped humano por la absorción de VB12. En las células animales, VB12 ayuda a la metionina sintasa en la catálisis de la metilación de homocisteína a metionina o ayuda a la metilmalonil-CoA mutasa para la conversión mitocondrial de metilmalonil-CoA a succinil-CoA15. Por lo tanto, un nivel bajo de VB12 podría inhibir estas reacciones bioquímicas, lo que provocaría una acumulación celular de homocisteína (Hcy) o ácido metilmalónico (MMA) y, posteriormente, un mayor riesgo de complicaciones (p. ej., hiperhomocisteinemia). Después del tratamiento con metformina durante cuatro semanas, la concentración sérica total de VB12 fue menor en los ratones con implantación intestinal de B. ovatus que en aquellos que no recibieron tratamiento con metformina, y la concentración sérica de MMA, un biomarcador sanguíneo típico de la homeostasis de VB12, fue significativamente menor. más alto (Fig. 4d, e). Consistentemente, los niveles de Hcy de los ratones colonizados con B. ovatus también se elevaron con el tratamiento con metformina. Además, el nivel de folato se redujo significativamente después del tratamiento con metformina y/o la colonización por B. ovatus (Fig. 4f, g).

a Introducción de la cepa B. ovatus en ratones con microbiota empobrecida (n = 5 ratones/grupo). b, c Cambios en veces de la abundancia relativa de B. ovatus en el contenido del colon y del intestino delgado de receptores de ratones según el análisis de q-PCR, respectivamente (n = 5). d Las concentraciones plasmáticas de VB12 (n = 5). e Las concentraciones plasmáticas de ácido metilmalónico (MMA) (n = 5). f Las concentraciones de homocisteína plasmática (Hcy) (n = 5). g Los niveles relativos de folato plasmático (n = 5). h Niveles de TG hepáticos (n = 5). i Tinción con Oil Red O en los tejidos del hígado; barras de escala, 50 μm (n = 3). j Tinción H&E de grasa subcutánea (sWAT); barras de escala, 100 μm (n = 3). k Tinción inmunohistológica con adiponectina de secciones sWAT; barras de escala, 50 μm (n = 3). l Imágenes representativas de la grasa perigonadal de ratones con diabetes tipo 2 colonizados con HFD y B.ovatus tratados con vehículo o metformina durante 4 semanas. m Se analizaron secciones de páncreas de ratón mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la insulina (rojo) y el glucagón (verde); barras de escala, 100 μm (n = 3). Valor de p determinado mediante la prueba U de Mann-Whitney (b, c, h), ANOVA unidireccional con las pruebas de Tukey o Dunnett (d, e, g) y prueba de Kruskal-Wallis (f). Todos los datos se presentan como media ± SEM o media ± DE.

La colina podría producirse a partir de la fosfatidilcolina recién formada en el hígado. La reacción bioquímica requiere S-adenosilmetionina como donante de metilo, que está regulado por los niveles de VB12 y folato, lo que refleja la capacidad de metilación celular26. Por lo tanto, un nivel bajo de VB12 o folato en el hígado puede reducir la disponibilidad de colina, lo que provoca una desregulación del metabolismo del colesterol y esteatosis hepática. El tratamiento con metformina redujo significativamente la deposición de grasa en ratones alimentados con HFD. Descubrimos que la eficacia de la metformina contra los depósitos de grasa en el hígado inducidos por la HFD se vio significativamente comprometida por la colonización de B. ovatus (Fig. 4h, i). Además, si bien el tratamiento con metformina podría reducir el tamaño de los adipocitos en los tejidos grasos, el efecto fue abolido en ratones con implantación intestinal de B. ovatus. Consistentemente, el aumento beneficioso en la expresión de adiponectina en los tejidos grasos después del tratamiento con metformina en ratones alimentados con HFD no se observó en los ratones con implantación intestinal de B. ovatus (Fig. 4j-l). El ácido fólico (AG) y VB12 pueden evitar que las células beta pancreáticas fallen al suprimir el estrés oxidativo27. El examen de inmunohistoquímica y estereología mostró que el volumen de los islotes no se vio afectado por el tratamiento con metformina solo o la implantación intestinal de B. ovatus sola en ratones alimentados con HFD; sin embargo, el volumen de los islotes fue mucho menor en los ratones alimentados con HFD que recibieron tratamiento con metformina e implantación intestinal de B. ovatus, junto con una cantidad reducida de células beta que se intercalaron entre una mayor cantidad de células alfa (Fig. 4m).

Además, se ha informado que VB12 y FA son antagonistas naturales del receptor de aril hidrocarburo (AhR), que pueden bloquear la localización nuclear del AhR28. Descubrimos que la administración de metformina en ratones colonizados con B. ovatus podría inducir la expresión relativa de AhR y su objetivo CYP1A1 en el hígado, lo que no se detectó en los ratones alimentados con HFD que recibieron tratamiento con metformina solo o implantación intestinal de B. ovatus sola ( Figuras 5a, b).

a Abundancia relativa de ARNm de Ahr, su gen diana Cyp1a1 en el hígado (n = 5). b Análisis de transferencia Western (recorte de imágenes de transferencia) de la expresión de las proteínas hepáticas AHR y CYP1A1 y gráfico estadístico (n = 3). c Gráfico de volcán de genes significativamente regulados al alza (rojo), regulados a la baja (verde) y genes no significativos (azul) en ratones del grupo B. ovatus + MET y metformina (n = 3). d Gráficos de enriquecimiento de la vía de digestión y absorción de vitaminas enriquecidos en el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA), que muestran el perfil de la puntuación ES en ejecución y las posiciones de los miembros del conjunto de genes en la lista ordenada por rango (n = 3). e Niveles relativos de ARNm de genes de absorción y transporte de VB12 (n = 5). f Expresión relativa de ARNm de genes de absorción de ácido fólico (n = 5). Valor de p determinado mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas (a, b), ANOVA unidireccional con las pruebas de Tukey (e, f) y la prueba de Kruskal-Wallis (e, f). Todos los datos se presentan como media ± SEM o media ± DE.

Para revelar aún más alteraciones en la absorción de cobalamina en ratones huéspedes, realizamos un análisis de secuencia de ARN con tejidos del íleon. Se identificaron un total de 3034 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre los ratones alimentados con HFD que recibieron implantación intestinal de B. ovatus solo y los que recibieron además tratamiento con metformina (Fig. 5c). Se descubrió que estos genes, incluidos los que codifican el complejo receptor IF-VB12 (Cubn), estaban enriquecidos en las vías de digestión y absorción de vitaminas en el análisis de la vía KEGG (Fig. 5d y Fig. Suplementaria 5a). Además, los datos de secuenciación también indicaron que el tratamiento con B. ovatus + metformina condujo a un aumento del metabolismo de la vía del reactivo de las vitaminas solubles en agua y a una regulación positiva de la función GO de unión al cofactor (Figuras complementarias 5b, c). Además, examinamos la expresión relativa de los genes implicados en la captación/degradación de IF-VB12 y el flujo/transporte de VB12. No se encontraron cambios significativos entre los ratones alimentados con HFD que recibieron implantación intestinal de B. ovatus solo y los que recibieron además tratamiento con metformina; sin embargo, la expresión de estos genes fue en general menor en los ratones alimentados con HFD que recibieron tratamiento con metformina solo (Fig. 5e). El gen Slc46a1 codifica una proteína transportadora de folato acoplada a protones transmembrana que, según se ha informado, aumenta en ratones con deficiencia de folato29. La expresión de Slc46a1 aumentó significativamente en el grupo B. ovatus + MET en comparación con el grupo B. ovatus, pero no en Slc19a1 (Fig. 5f, Fig. complementaria 5d). En general, estos datos sugieren que el enriquecimiento de B. ovatus en el intestino puede agravar la deficiencia de VB12 inducida por metformina al capturar cobalamina en lugar de alterar la absorción de VB12.

Las manifestaciones clínicas de la deficiencia de VB12, como la anemia megaloblástica clásica, la hiperhomocisteinemia, la neuropatía periférica y los déficits cognitivos, pueden reducir el beneficio potencial de la metformina. Aunque existen biomarcadores sanguíneos clásicos (VB12 total, holotranscobalamina, Hcy y MMA), el diagnóstico de la deficiencia de VB12 es difícil debido a su asociación con otras enfermedades, como trastornos autoinmunes, insuficiencia renal y enfermedad de Alzheimer15. Una variedad de factores podrían contribuir a la deficiencia de VB12, como la falta de consumo de alimentos que contengan VB12, una reducción en la producción de ácido gástrico, alteraciones en la función de la membrana dependiente del calcio y la presencia de SIBO, deficiencia del factor intrínseco y disfunción lisosomal. VB12 solo es sintetizado por ciertas bacterias y arqueas y está disponible en animales o peces como resultado de interacciones microbianas-huésped15. Si bien las plantas no contienen VB12, a los pacientes con diabetes tipo 2 generalmente se les recomienda aumentar la ingesta de frutas, verduras, cereales integrales y legumbres y disminuir el consumo de carnes rojas, grasas saturadas y alimentos ricos en carbohidratos. Algunos pacientes incluso optan por hacerse vegetarianos, lo que limita sus fuentes alimenticias de VB12 y también puede alterar la composición de su microbiota intestinal. Aunque la microbiota juega un papel importante al contribuir con cofactores esenciales al huésped, las fuentes microbianas de VB12 generalmente se acumulan en animales rumiantes herbívoros en lugar de en humanos. Además, la microbiota intestinal podría convertir la VB12 de la dieta en corrinoides alternativos que son difíciles de utilizar directamente para los humanos19. Por lo tanto, la microbiota intestinal, que carece de vías biosintéticas de vitaminas, puede interferir con la absorción de VB12 del huésped. Sin embargo, el obstáculo que plantea la microbiota a la absorción de VB12 por parte del huésped aún no se ha confirmado, particularmente en el contexto de la terapia farmacológica del huésped.

B. ovatus es una bacteria intestinal humana común con varios loci que utilizan polisacáridos30,31 que pueden degradarse y crecer en fibras dietéticas complejas de origen vegetal. Expresa transposones conjugativos que codifican el transporte de corrinoides, que son móviles y provocan el intercambio de genes necesarios para el transporte de corrinoides para permitir la colonización21. Nuestros datos muestran que B. ovatus podría colonizar el intestino delgado para transportar VB12 y agravar la deficiencia de VB12 inducida por metformina en el huésped.

El uso de metformina se ha asociado con cambios en la composición del microbioma intestinal humano y podría alterar la expresión de los genes que codifican metaloproteínas o transportadores de metales en la microbiota intestinal de pacientes con diabetes tipo 232,33. Si bien la metformina no es un antibiótico, puede inhibir el crecimiento de algunas bacterias, como B. fragilis34 y E. coli OP5035, para las cuales el tratamiento con metformina puede provocar niveles elevados de 5-metil-tetrahidrofolato y niveles reducidos de metionina. Por tanto, el tratamiento con metformina puede interferir con el metabolismo de un carbono de la bacteria, que depende de VB12 como cofactor. Observamos que la metformina pudo aumentar el contenido celular de VB12 en estas bacterias mediante la regulación positiva de la expresión de TonB o btuB. Sin embargo, es posible que el VB12 que es capturado por las proteínas IM no pase a través de la membrana celular citoplásmica interna porque la metformina podría influir en la actividad de las proteínas transportadoras IM ABC, que se activan mediante la hidrólisis de ATP. Descubrimos que la metformina podría inhibir la cadena de transporte de electrones en E. coli, lo que provocaría una disminución de la producción de ATP. Por lo tanto, la concentración elevada de VB12 y la regulación positiva de TonB no causaron una mayor expresión de metH y scpA debido a ExbBD deficiente en ATP. Sin embargo, debido a que la metformina podría regular positivamente la ATP sintasa en B. ovatus, el VB12 capturado por BtuB en esta cepa podría transportarse continuamente a través del periplasma y luego al citoplasma (Fig. 6). De hecho, además de la cobalamina, los transportadores dependientes de TonB también podrían importar otros sustratos, como complejos de hierro, quelatos de níquel y carbohidratos16. Estos sustratos son importantes para mantener el crecimiento bacteriano y la salud humana porque facilitan la conversión de nutrientes químicos en biomasa. Por lo tanto, nuestros hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre el efecto de la metformina en la interacción entre la microbiota intestinal y los huéspedes.

Por el contrario, la metformina regula positivamente el complejo V de la cadena respiratoria de B. ovatus, y VB12 podría transportarse a través de la membrana interna hasta el citoplasma. El diagrama fue creado usando BioRender.

Demostramos que la deficiencia de VB12 fue inducida más fácilmente por la metformina en ratones colonizados con B. ovatus, pero no en ratones con B. ovatus solo. Curiosamente, si bien la metformina podría inhibir significativamente la absorción de VB12 en ratones alimentados con HFD, la absorción no se vio afectada en los ratones que recibieron implantación de B. ovatus y tratamiento con metformina. La regulación negativa de la expresión genética se relacionó con varios procesos en los ratones que recibieron tratamiento con metformina sola, incluida la complejación de VB12 con cubilina (Cubn), el transporte de VB12 fuera de los lisosomas (Lmbrd1), la conversión de VB12 en adenosilcobalamina y metilcobalamina (Mmachc ), y el transporte de VB12 desde el torrente sanguíneo a las células (Tcn2), indicaron que la metformina puede alterar directamente la absorción ileal de VB12. Además, la metformina inhibió la actividad de la ATPasa de tipo vacuolar (V-ATPasa) a través del eje PEN2-ATP6AP136. La V-ATPasa ejerce una función crucial en la acidificación lisosomal para activar proteasas ácidas que son esenciales para la degradación de IF y la posterior liberación de VB12 en el citoplasma15. Por tanto, la deficiencia de VB12 inducida por metformina podría deberse a una disfunción lisosomal. La deficiencia de VB12 asociada al tratamiento prolongado con metformina se ha observado en pacientes de diferentes países y de diferentes etnias37,38, con una prevalencia muy variable (entre el 5,8% y el 33%)2. La elevada heterogeneidad difícilmente puede explicarse únicamente por factores del huésped. Hay entre 500 y 1000 especies microbianas diferentes que residen en el tracto intestinal de cada persona, y la microbiota intestinal se caracteriza por una gran variabilidad interindividual regulada por la variación genética, factores maternos, nutrición, estado fisiológico, drogas e incluso estrés social, que afectan su capacidad para ocupar y competir por espacios y recursos limitados. Por lo tanto, la sorprendente diversidad de estas comunidades comensales taxonómicas y funcionales podría funcionar como factores mediadores para influir en el estado del huésped VB12. B. ovatus se encontró en el 70,053% de las personas sanas (n = 11.406, GMrepo). En nuestros datos anteriores, los individuos con diabetes tipo 2 albergaban abundancias relativas únicas entre el 0% y el 32,5% (n = 112) con una alta variación (1,31% ± 3,73%), lo que sugiere que la compleja interacción entre B. ovatus y el huésped con respecto a la cobalamina podría incluso extenderse a otras Bacteroides spp. En conjunto, nuestros hallazgos resaltan la importancia de las bacterias intestinales, especialmente B. ovatus, en la deficiencia de VB12 asociada con el uso de metformina.

En este estudio, hemos identificado a B. ovatus como un mediador que redujo la VB12 plasmática del huésped en tratamiento con metformina. Sin embargo, se desconocen las estructuras de dominio exactas de los transportadores dependientes de TonB en B. ovatus. Se informó que las características estructurales de los TBDT en B. thetaiotaomicron con al menos tres subtipos distintos que regulan de diferentes maneras para ajustar la absorción de nutrientes39. B. ovatus despliega múltiples PUL para absorber diferentes tipos de carbohidratos complejos y podría promover el crecimiento de P. vulgatus40. Una pregunta crítica es si B. ovatus también codifica TBDT únicos para utilizar nutrientes, lo cual aún está por determinar.

En conclusión, los pacientes con diabetes tipo 2 con abundante B. ovatus en el intestino pueden tener más probabilidades de sufrir deficiencia de VB12 cuando se tratan con metformina, que mejora la capacidad bacteriana para la absorción de VB12. La metformina puede actuar sobre la cadena respiratoria de diferentes maneras en la regulación del ciclo de vida bacteriano y las interacciones huésped-microbiota. Por lo tanto, se pueden considerar pruebas de rutina de los niveles séricos de VB12 y homocisteína en pacientes con diabetes tipo 2 tratados con metformina a largo plazo, especialmente en pacientes ricos en B. ovatus. Se debe prestar más atención a las diversas cuestiones de seguridad de la metformina teniendo en cuenta la microbiota intestinal personal única, especialmente la correlación de la DPN con las bacterias.

Los sujetos diagnosticados con diabetes tipo 2 entre abril de 2019 y junio de 2020 en el Hospital Central de Zhengzhou afiliado a la Universidad de Zhengzhou fueron reclutados de acuerdo con estrictos criterios de inclusión y exclusión: para el estudio se reclutaron pacientes chinos con DM2 recién diagnosticada (de 18 a 65 años; 18,5 kg). /m2 < IMC < 35,0 kg/m2) y nunca ha sido tratado con medicamentos antidiabéticos antes de este estudio. Los criterios de exclusión fueron: (1) diabetes tipo 1, diabetes gestacional u otra diabetes secundaria; (2) uso continuo de antibióticos o probióticos durante> 3 días dentro de los 3 meses anteriores a la inscripción; (3) un evento de hipoglucemia grave (niveles de glucosa en sangre ≤ 3,9 mmol/L) de causa desconocida ocurrió dentro de los 3 meses anteriores a este estudio; (4) antecedentes médicos de cetoacidosis diabética, acidosis láctica o síndrome hiperosmolar no cetósico; (5) insuficiencia orgánica o complicaciones clínicamente significativas: enfermedades hepáticas graves (incluidas hepatitis crónica persistente, cirrosis hepática o la coexistencia de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B positivo y transaminasas hepáticas anormales (concentraciones séricas de alanina transaminasa o aspartato transaminasa >2,5 veces la límite superior normal); enfermedad renal grave (creatinina > 2 mg/dl); enfermedades orgánicas graves, incluyendo cáncer, enfermedad coronaria, infarto de miocardio o apoplejía cerebral; enfermedades infecciosas, incluyendo tuberculosis pulmonar y portador de VIH; complicaciones diabéticas graves (retinopatía diabética , neuropatía diabética, nefropatía diabética y pie diabético); disfunción pituitaria; receptor de trasplante; cirugía gastrointestinal (excepto cirugía de apendicitis o hernia); enfermedad mental grave dentro de los 6 meses anteriores a la inscripción; enfermedad hemorrágica o tendencia hemorrágica; presión arterial sistólica ≥160 mmHg o presión arterial diastólica ≥100 mmHg, anemia (para hombres, menos de 12,0 gramos por decilitro; para las mujeres, menos de 11,0 gramos por decilitro); (6) trastornos endocrinos inmunológicos asociados con niveles altos de azúcar en sangre; (7) uso continuo de fármacos para bajar de peso durante > 1 mes; (8) alcoholismo; (9) alergia a medicamentos y alta sensibilidad a sustancias ambientales; (10) tratamiento con inductores o inhibidores moderados y potentes de CYP3A4; (11) embarazo, lactancia, intención de quedar embarazada durante el curso del estudio.

A los participantes se les administró un tratamiento con clorhidrato de metformina (1000 mg dos veces al día durante 1 a 2 semanas, luego 2000 mg por día, Sino-American Shanghai Squibb Pharmaceuticals Ltd.). Dicho tratamiento duró de 12 a 24 semanas, los participantes fueron asignados al grupo con deficiencia (VB12 total en suero < 200 pg/mL) o al grupo sin deficiencia (VB12 total en suero > 200 pg/mL). Al final de la intervención se realizaron mediciones antropométricas, muestras biológicas y pruebas metabólicas. Las muestras de sangre periférica se centrifugaron a 3320 gy 4 °C durante 10 minutos para obtener el plasma. Los niveles de indicadores bioquímicos en sangre se midieron mediante un autoanalizador. Las heces se recogieron y almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

El ADN genómico fecal humano se extrajo utilizando un kit de ADN magnético para suelos y heces (TIANGEN Biotech) y se secuenció en la plataforma Illumina novaseq, y se generaron lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Después de eliminar lecturas de baja calidad (con una puntuación de calidad <20), adaptadores de secuenciación y lecturas de menos de 80 pb utilizando Trim Galore, obtuvimos un promedio de 72,6 millones (rango de 65,9 a 86,2 millones) de lecturas limpias de alta calidad para cada muestra fecal. . Las lecturas limpias se asignaron al genoma de referencia humano (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/) utilizando Bowtie2 (versión 2.3.1, parámetros predeterminados). Las lecturas no asignadas se ensamblaron utilizando metaSPAdes (SPAdes-3.13.1, tamaños de k-mer: 21, 33, 55, 77) y se controlaron mediante QUAST. Luego, los contigs de más de 500 pb se usaron para predecir genes con MetaGeneMark (GeneMark.hmm versión 3.38). Se construyó un catálogo de genes no redundante con CD-HIT con un límite de identidad de secuencia de 0,9 y un límite de cobertura mínimo de 0,9 para las secuencias más cortas. La abundancia de genes en cada muestra se calculó mapeando el catálogo de genes no redundante, contando el número de lecturas alineadas (profundidad de samtools, parámetros predeterminados) y normalizando por longitud de gen, luego se transformó a abundancia relativa por (10000000 × (x/ suma(x))). El perfil taxonómico de las muestras metagenómicas se realizó utilizando MetaPhlAn 4.0.6 (con la base de datos de referencia mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212, incluida la clasificación taxonómica de bacterias, arqueas y hongos)41. Las anotaciones funcionales de genes recién ensamblados se realizaron utilizando KOBAS (versión 3.0, parámetros predeterminados) contra KEGG (//kobas.cbi.pku.edu.cn/). La abundancia de una ortología/módulo KEGG se calculó sumando las abundancias de genes anotados en la misma característica. Los análisis posteriores se realizaron en R (versión 3.5.1; 4.2.0) utilizando múltiples paquetes, incluidos reshape2, vegan, ggplot2, Maaslin2 y ALDEx2. La diversidad beta se calculó en función de las distancias de Bray-Curtis (datos normalizados) y la matriz de distancias utilizada para realizar un análisis de coordenadas principales de ordenación (PCoA). El análisis LEfSe se realizó utilizando Galaxy42. Bubble Plot se analizó en la herramienta en línea de Majorbio Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com/page/tools/). La clasificación aleatoria del aprendizaje automático de bosques se realizó utilizando el paquete R “randomForest” con 500 árboles y una validación cruzada diez veces mayor para identificar biomarcadores microbianos óptimos.

B. ovatus (ATCC 8483) se sembró en una placa de agar con infusión de cerebro-corazón (BHI, OXOID) en una estación de trabajo anaeróbica a 37 °C (10 % CO2, 10 % H2 y 80 % N2) durante 48 h. Se usó una sola colonia para inocular 5 ml de BHI (suplementado con 5% de FBS) y los cultivos de semillas se suspendieron durante 7 a 8 h a 37 °C hasta su período de crecimiento logarítmico. Se sembró Escherichia coli K-12 MG1655 sobre una placa de caldo de agar Luria-Bertani (LB, invitrogen) en una estación de trabajo aeróbica a 37 °C durante 48 h. Se suspendieron cultivos de semillas de una sola colonia durante 3 a 4 h a 37 °C hasta su período de crecimiento logarítmico. Se sembraron bacterias en 96 placas multipocillos en presencia o ausencia de metformina (40 μM, 1,5 mM y 10 mM, Sigma-Aldrich) y los valores de DO600 se midieron cada hora utilizando un espectrofotómetro de microplacas BioTekEon.

Para la colonización de bacterias, se administró por vía oral a ratones B. ovatus suspendidos en 200 μl de PBS anaeróbico (1,0 x 108 unidades formadoras de colonias por ratón) cada día durante 10 semanas.

La concentración de cianocobalamina en bacterias se midió mediante cromatografía líquida selectiva y altamente sensible junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS; AB SCIEX, EE. UU., Triple Quad 6500 +). En resumen, E. coli se cultivó en medio LB y se incubó aeróbicamente a 37 ˚C durante la noche, y luego se mantuvo y expandió en un medio M9 sin cobalamina. La E. coli se trató con cianocobalamina 3,7 nM (Sigma-Aldrich) y metformina (0, 40 μM, 1,5 mM y 10 mM) en la oscuridad durante 1 h. B. ovatus se cultivó en medios mínimos (KH2PO4 (100 mM), NaCl (15 mM), (NH4)2SO4 (8,5 mM), L-cisteína (4 mM), VK3 (1 μg/mL), hematina (1,9 μM ), L-histidina (200 μM), MgCl2 (100 μM), FeSO4.7H2O (1,4 μM), CaCl2 (50 μM), glucosa (0,50%)) suplementados cuando se especifique con cianocobalamina 3,7 nM y metformina (0,40 μM). , 1,5 mM y 10 mM) en la oscuridad durante 7 h. A continuación, las bacterias se sedimentaron y se lavaron con 1 × PBS (pH 7,4) tres veces, y se agregaron 100 µl de agua MilliQ que contenía estándares internos (IS, metotrexato, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) al sedimento de bacterias. Luego, la mezcla con 300 μL de H2O:MeOH fría 20:80 (ácido ascórbico al 0,1% y beta-mercaptoetanol) se agitó y se sonicó. A continuación, se agregaron 400 μl de MeOH frío y se agitaron nuevamente para almacenar a -80 °C durante 8 h. Los sobrenadantes se recogieron, se secaron bajo flujo de N2, se resuspendieron en fase móvil y se mantuvieron a 4 °C en un muestreador automático. Se analizó una alícuota de 3 µl de sobrenadante mediante LC-MS/MS. El caudal se ajustó a 0,3 ml/min. La separación cromatográfica se realizó en una columna analítica ACQUITY UPLC HSST3 C18 (1,8 µm, 2,1 mm x 100 mm). La fase móvil incluía una mezcla de ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y acetonitrilo (B). Se aplicó la elución en gradiente y la detección por MS prosiguió en modo positivo. Los datos se recogieron con un monitor de reacciones múltiples. Los parámetros de MS/MS optimizados para el método se muestran en la Tabla complementaria 2. El gradiente se configuró de la siguiente manera: 10%–30% B a 0–4 min, 30%–10% B a 4–5 min. Los datos de adquisición se analizado utilizando el software Analyst para la integración de picos, ecuaciones de calibración y cuantificación de cianocobalamina. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron mediante el kit 2-D Quant (GE Healthcare) para normalizar la cantidad de bacterias.

(i) El límite inferior de cuantificación (LLOQ) y linealidad: las relaciones de área de pico para estos compuestos e IS se calcularon para construir las curvas de calibración con regresión lineal de mínimos cuadrados ponderada (1/x). El LLOQ fue la concentración más baja que pudo cuantificarse con una precisión y exactitud aceptables. Y su intensidad máxima fue al menos la relación señal-ruido (S/N) de aproximadamente 10. Los datos se mostraron en la Tabla complementaria 3. (ii) Precisión y exactitud intra e interdía: la intensidad alta, media , se prepararon niveles bajos de concentración de muestras de control de calidad para evaluar la precisión y exactitud intra e interdía, y la relación entre la concentración determinada y la concentración agregada debe estar entre 85% y 115%, dentro de un día o en tres días consecutivos. . La precisión y exactitud intra e interdía para todos esos analitos se muestran en la Tabla complementaria 4. (iii) Recuperación de la extracción y efecto de la matriz: la evaluación de un extractante adecuado se evaluó calculando la recuperación de la extracción y el efecto de la matriz. La recuperación de la extracción se calculó utilizando la relación analito/área del pico IS (A1) detectada en muestras biológicas extraídas versus aquellas (A2) enriquecidas después de la extracción de estas soluciones de muestra de control de calidad en las mismas concentraciones. Los efectos de la matriz se presentaron mediante la relación entre las áreas de los picos de A2 y las de las soluciones de trabajo que contienen cantidades equivalentes de estos compuestos (A3). La recuperación de la extracción y el efecto de la matriz de todos los compuestos se proporcionaron en la Tabla complementaria 5.

El ARN total se extrajo de E. coli o B. ovatus utilizando el mini kit RNeasy Protect Bacteria (Qiagen) y se secuenció en la plataforma illumina novaseq 6000, y se generaron lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Se cultivaron tres cultivos biológicos replicados de B. ovatus o E. coli en metformina (0 mM o 1,5 mM) durante 7 h. Las reacciones de secuenciación de las doce muestras produjeron cada una entre 24,2 y 30,9 millones de lecturas limpias; todas las muestras tenían aproximadamente 93% de bases con una puntuación de calidad superior a 30. Los datos de RNA-seq se evaluaron utilizando FastQC. Las lecturas limpias se asignaron al genoma de referencia (GCF_000154125.1_ASM15412v1_genomic.fna y GCF_000005845.2_ASM584v2_genomic.fna) usando Bowtie2 (//bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml). Se utilizó HTSeq 0.6.1p2 (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq) para obtener el recuento total de lecturas asociado con un gen. Los genes expresados ​​diferencialmente fueron evaluados tanto por DESeq2 como por edgeR (el valor de P fue menor o igual a 0,05). La trama del volcán se creó en R 4.2.0 y los paquetes R (ggpubr y ggthemes).

E. coli se cultivó en medio LB y se incubó aeróbicamente a 37 °C durante 7 h, luego se trató con metformina (0, 40 μM, 1,5 mM y 10 mM) en la oscuridad durante 1 h. B. ovatus se cultivó en medio BHI (suplementado con 5% de FBS) suplementado con metformina (0, 40 µM, 1,5 mM y 10 mM) en la oscuridad durante 7 h, y luego se incubó con vehículo u oligomicina A (2 µM) durante 1 h. El nivel de ATP intracelular se determinó utilizando el kit de ensayo de ATP (Beyotime). Y las concentraciones de proteínas de los homogeneizados de bacterias se cuantificaron mediante el ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific).

E. coli se cultivó en medio LB y se incubó aeróbicamente a 37 °C durante 7 h. Y luego se trató con metformina (0 y 1,5 mM) en oscuridad durante 1 h. B. ovatus se cultivó en medio BHI (suplementado con 5% de FBS) suplementado con metformina (0, 40 μM, 1,5 mM y 10 mM) en la oscuridad durante 7 h. El potencial de membrana bacteriana se detectó utilizando el kit de potencial de membrana bacteriana BacLight™ (Thermo Fisher Scientific). En resumen, se resuspendieron E. coli o B. ovatus en 1X PBS y se trataron con EDTA 10 mM durante 5 min o 10 min. Las bacterias tratadas con EDTA se centrifugaron y se resuspendieron en 1X PBS. Se añadió una solución madre de DiOC2(3) 3 mM en DMSO a las bacterias (volumen final de 200 µl en una microplaca opaca de 96 pocillos) para obtener una concentración final de 30 µM. 15 minutos después de la incubación a temperatura ambiente, se detectó el potencial de membrana mediante un lector fluorescente bajo Ex450/Em670 nm.

E. coli se cultivó en medio LB y se incubó aeróbicamente a 37 °C durante 7 h. Y luego se trató con metformina (0 y 1,5 mM) y/o aceptores terminales de electrones (DMSO (1%); TMAO (4 μM) y NaNO2 (18 mM)) en oscuridad durante 1 h. B. ovatus se cultivó en medio BHI (suplementado con 5% de FBS) suplementado con metformina (0 y 10 mM) en la oscuridad durante 7 h. Los niveles intracelulares totales de NAD+ y NADH se midieron utilizando un kit de ensayo de relación NAD+/NADH fluorimétrico Amplite™ *fluorescencia roja. Brevemente, las bacterias se homogeneizaron en tampón de lisis y luego se centrifugaron. A continuación, se calentó el sobrenadante en tampón de extracción NAD+ o NADH a 37 °C durante 15 minutos y se añadió el mismo volumen de tampón de extracción opuesto para neutralizar la muestra. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 h, un lector fluorescente pudo detectar el aumento de fluorescencia de los estándares o muestras en Ex540/Em590 nm.

El ADN genómico del contenido fecal y del intestino delgado se extrajo utilizando el kit QIAamp PowerFecal Pro DNA. Se realizó la RT-qPCR para cuantificar la abundancia relativa de B. ovatus.

El ARN se extrajo de bacterias mediante un método de fenol caliente. Y el ARN se extrajo de los tejidos con reactivo Trizol (invitrogen) mediante una extracción estándar con cloroformo y alcohol isoamílico. Se transcribió inversamente 1 μg de ARN total utilizando un kit de transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles relativos de expresión de ARNm se determinaron mediante qPCR utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). Las secuencias de los cebadores se resumen en la Tabla complementaria 6.

Se alojaron ratones macho SPF de la cepa C57BL/6J (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd) en una instalación para animales libre de patógenos en condiciones estándar de laboratorio (ciclos de luz y oscuridad de 12 h, con la temperatura mantenida entre 21 y 24 °C). y la humedad entre 40 y 70%) y se les dio libre acceso a alimentos y agua. Los ratones fueron alimentados con un cóctel de antibióticos que consistía en vancomicina 50 mg/kg, neomicina 100 mg/kg, metronidazol 100 mg/kg, anfotericina B 1 mg/kg y ampicilina 1 mg/ml durante 7 días. Los ratones con microbiota intestinal agotada (de 6 semanas de edad) fueron trasplantados con B. ovatus o PBS y alimentados con una dieta alta en grasas (HFD, 60% kcal de grasa, D12492, Dietas de investigación) durante 10 semanas seguidas.

Veinte ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos y se les administraron por vía oral los siguientes agentes (n = 5 ratones/grupo): (1) grupo HFD: HFD + vehículo; (2) Grupo de metformina: HFD + metformina (200 mg/kg/día, 4 semanas, vo); (3) grupo B. ovatus: vehículo de control; (4) B. ovatus + grupo MET: metformina (200 mg/kg/día, 4 semanas, vo).

Los animales fueron anestesiados con isoflurano para recolectar muestras de sangre mediante punción del seno retroorbitario. Otras muestras (hígado, íleon, contenido del intestino delgado, contenido del colon, páncreas y tejido adiposo) se recogieron y almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

El nivel de VB12, MMA y Hcy en plasma total se midieron utilizando el kit ELISA VB12 de ratón (J&L Biological), el kit ELISA de ácido metilmalónico de ratón (J&L Biological) y el kit ELISA Hcy de ratón (mlbio), respectivamente.

El ácido fólico en plasma se detectó mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento acoplada a un método de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (AB SCIEX, EE. UU., Triple Quad 6500+). El caudal se ajustó a 0,2 ml/min. La separación cromatográfica se realizó en una columna analítica ACQUITY UPLC HSST3 C18 (1,8 µm, 2,1 mm x 100 mm). La fase móvil incluía una mezcla de ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y acetonitrilo (B). Se aplicó la elución en gradiente y la detección por MS prosiguió en modo positivo. Los datos se recogieron con un monitor de reacciones múltiples. Los parámetros de MS/MS optimizados para el método se muestran en la Tabla complementaria 7. El gradiente se estableció de la siguiente manera: 5% –5% B 0–0,5 min, 5%–80% B 0,5–5 min, 80%–80% B 5–6 min, 80%–5% B 6–6,1 min, 5%–5% B 6,1–8 min. Se mezcló una alícuota de 50 µL de muestra de plasma con 150 µL de H2O fría 20:80: MeOH (ácido ascórbico y ácido fórmico al 0,1%) que contenía estándar interno (IS), se agitó y luego se centrifugó a 13.000 g, 4 °C durante 10 min. . Se analizó una alícuota de 2 µl de sobrenadante mediante LC-MS/MS. La cuantificación relativa se calculó utilizando la relación analito/área del pico IS detectada a partir del producto biológico extraído.

Los tejidos del hígado se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con aceite rojo O (ORO). Los tejidos adiposos se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron mediante inmunotinción con anticuerpo adiponectina (Bioss, Cat# bs-0471R, 1:200). Las secciones de tejido adiposo también se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Para la tinción por inmunofluorescencia, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos de insulina (Proteintech, Cat# 15848-1-AP, 1:100) y glucagón (Proteintech, Cat# 67286-1-Ig, 1:200) y se contratiñeron con DAPI para obtener imágenes.

La proteína de los tejidos se separó mediante electroforesis SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. La membrana se incubó con anticuerpos primarios contra AHR (Proteintech, Cat# 17840-1-AP, 1:1000), CYP1A1 (Proteintech, Cat# 13241-1-AP, 1:1000) o GAPDH (Cell Signaling Technology, Cat# # 2118, 1:20000) durante la noche a 4ºC.

El ARN total se extrajo del tejido ileal del ratón utilizando el reactivo TRIzol. Las muestras se sometieron a secuenciación de extremos pares de 150 pb utilizando la plataforma Illumina novaseq 6000. Se obtuvieron lecturas limpias eliminando lecturas que contenían adaptador, lecturas que contenían base N y lecturas de baja calidad (Qphred <= 20) de los datos sin procesar. Luego, las lecturas se alinearon con el genoma del ratón (Mus_musculus.GRCm39.dna.primaryassembly.fa) utilizando Hisat2 (versión 2.0.5), y se utilizó featureCounts (versión 1.5.0-p3) para contar los números de lecturas asignados a cada gene. La cobertura de lectura promedio fue de 43.675.559 lecturas/muestra con un promedio del 96% de las lecturas asignadas exitosamente al genoma del ratón. Las lecturas secuenciadas se normalizaron a FPKM y los genes expresados ​​diferencialmente entre B. ovatus + MET y metformina o tejidos ileales de ratón B. ovatus se determinaron utilizando el paquete DESeq2 R. Los análisis de enriquecimiento se realizaron utilizando clusterProfiler (versión 3.4.4). La versión local de la herramienta de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, los conjuntos de datos GO, KEGG, Reactome, DO y DisGeNET se utilizaron para GSEA de forma independiente. Los valores de p de las comparaciones múltiples se ajustaron con el método FDR original de Benjamini y Hochberg, FDR <0,05. El valor de P corregido de 0,05 y el cambio absoluto de 2 se establecieron como umbral para una expresión significativamente diferencial.

Para el análisis estadístico se utilizaron GraphPad Prism versión 8.0, IBM SPSS Statistics 26 y R (versiones 3.5.1 y 4.2.0). Los datos experimentales se mostraron como media ± SEM o media ± DE. El tamaño de la muestra se estimó sobre la base de la experiencia previa, la disponibilidad de muestras y estudios informados previamente. No se excluyeron datos del análisis de datos. Se utilizaron pruebas t de Student independientes no apareadas (entre dos grupos) y ANOVA unidireccional con pruebas de Tukey o Dunnett (entre múltiples grupos) para comparar diferencias sobre varianzas homogéneas y distribuidas normalmente. Los datos heterogéneos o no distribuidos normalmente se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, entre dos grupos) o la prueba de Kruskal-Wallis (entre múltiples grupos). Se utilizó un valor de P (FDR) ajustado de Benjamini-Hochberg de 0,05 como punto de corte para la significación estadística, a menos que se indique lo contrario. El análisis de correlación del microbioma intestinal y las características clínicas de los sujetos se investigaron mediante la prueba del coeficiente de correlación de rangos de Spearman. La significancia estadística se indica mediante asteriscos (*): *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, no significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Se puede acceder a los datos sin procesar del metagenoma y a las lecturas de secuenciación de ARN bacteriano a través del archivo de lectura de secuencias del NCBI (PRJNA910923 y PRJNA989277, respectivamente). Todos los demás datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

En este estudio no se crearon nuevos scripts o códigos de análisis de R.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (No. 2021YFA1301200), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82073945, 82074000 y 81874329), el Proyecto de Innovación en Investigación Científica de Posgrado de la Provincia de Hunan (No. CX20200121), los Fondos de Investigación Fundamental para Universidades Centrales de la Universidad Central Sur (No. 2020zzts252) y el Programa de Proyectos del Centro Nacional de Investigación Clínica para Trastornos Geriátricos (Hospital Xiangya, Subvención No. 2020LNJJ06). Los autores agradecen a los participantes (RL y YLP) por su amable asistencia y cooperación en el estudio, y al Centro de Computación de Alto Rendimiento de la Universidad Central Sur por el apoyo parcial de este trabajo.

Departamento de Farmacología Clínica, Hospital Xiangya, Universidad Central Sur, Changsha, República Popular China

Manyun Chen, Yan Shu, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang y Wei Zhang

Instituto de Farmacología Clínica, Universidad Central Sur, Laboratorio Clave de Farmacogenética de Hunan, Changsha, República Popular China

Manyun Chen, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang y Wei Zhang

Centro de Investigación en Ingeniería de Tecnología Aplicada de Farmacogenómica, Ministerio de Educación, Changsha, República Popular China

Manyun Chen, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang y Wei Zhang

Centro Nacional de Investigación Clínica para Trastornos Geriátricos, Changsha, República Popular China

Manyun Chen, Qing Li, Honghao Zhou, Weihua Huang y Wei Zhang

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Farmacia, Universidad de Maryland en Baltimore, Baltimore, MD, EE. UU.

Yanshu

Hospital Central de Zhengzhou afiliado a la Universidad de Zhengzhou, Universidad de Zhengzhou, Zhengzhou, República Popular China

Zhiqiang Kang

Centro de Shenzhen para el Control y la Prevención de Enfermedades Crónicas, Shenzhen, RP China

Tao Liu

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WZ y WHH concibieron y supervisaron el estudio. MYC concibió el diseño experimental, realizó los principales experimentos in vitro/vivo, participó en la interpretación de datos y redactó el borrador original. YS, QL y HHZ revisaron y editaron el manuscrito. ZQK inscribió pacientes y gestionó la recolección de heces de los pacientes. TL gestionó la secuenciación de muestras de heces. WZ es el garante de este trabajo y, como tal, tuvo acceso completo a todos los datos del estudio y asume la responsabilidad de la integridad de los datos y la precisión del análisis de los mismos. Todos los autores participaron en la edición del artículo y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Weihua Huang o Wei Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La cohorte fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Hospital Xiangya, Universidad Central Sur (ID: 2019040116) y cumplió con la declaración de Helsinki y las buenas prácticas clínicas. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la inscripción. Todos los participantes recibieron educación sobre diabetes, antropometría, evaluaciones metabólicas y ensayos bioquímicos. Este estudio se registró en el Registro de ensayos clínicos de China (ChiCTR1900022997). Los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las pautas del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Central Sur y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (No. CSU-2022-0403).

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Chen, M., Shu, Y., Li, Q. et al. Bacteroides ovatus acelera la deficiencia de vitamina B12 inducida por metformina en pacientes con diabetes tipo 2 al acumular cobalamina. npj Biofilms Microbiomes 9, 51 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00419-y

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Recibido: 25 de febrero de 2023

Aceptado: 10 de julio de 2023

Publicado: 24 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00419-y

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